De huidige status van neuroprotectie bij aangeboren hartziekten, deel 2

De microscopische beelden werden vervolgens onderworpen aan beeldberekening met behulp van ImageJ-software (National Institutes of Health, Bethesda, MD, VS). Het signaal van Hsp60 werd vermenigvuldigd met "x".

Hsp60 is een belangrijk eiwitmolecuul dat een belangrijke biologische rol speelt in het menselijk lichaam. Uit onderzoek van de afgelopen jaren is gebleken dat de aanwezigheid van Hsp60 nauw verband houdt met het menselijk geheugen.

Hsp60 is een moleculair chaperonne-eiwit dat voornamelijk betrokken is bij het vouwen, ontvouwen, stabiliseren en afbreken van eiwitten. Deze processen zijn erg belangrijk voor het normale metabolisme en de cellulaire functie van het menselijk lichaam. Tegelijkertijd heeft Hsp60 ook antioxiderende, ontstekingsremmende en immunomodulerende effecten en speelt het een grote rol bij het handhaven van de menselijke gezondheid en het evenwicht van het immuunsysteem.

Uit onderzoek is gebleken dat Hsp60 een cruciale rol speelt bij de vorming en het onderhoud van het geheugen. Tijdens het leer- en geheugenproces produceren hersencellen een groot aantal Hsp60-moleculen. Deze moleculen kunnen cellen beschermen tegen interferentie en schade door de externe omgeving om een ​​soepele voortgang van leren en geheugen te garanderen. Daarnaast kan Hsp60 ook het menselijk denken en gedrag beïnvloeden door de signaaloverdracht van hersencellen en de ontwikkeling van neuronen te veranderen en heeft het een positieve invloed op de cognitie en stressbestendigheid.

Hoewel de rol van Hsp60 positieve effecten op het menselijk lichaam heeft aangetoond, moeten mensen zich ook realiseren dat zowel een teveel als een tekort aan Hsp60 negatieve effecten op de menselijke gezondheid kunnen hebben. Daarom moeten we het mechanisme van Hsp60 in verschillende fysiologische en pathologische omstandigheden van het menselijk lichaam actief onderzoeken en bestuderen om de positie en rol van Hsp60 in de menselijke gezondheid beter te begrijpen. Het is duidelijk dat we het geheugen moeten verbeteren, en Cistanche deserticola kan het geheugen aanzienlijk verbeteren, omdat Cistanche deserticola antioxiderende, ontstekingsremmende en anti-verouderingseffecten heeft, die kunnen helpen oxidatie- en ontstekingsreacties in de hersenen te verminderen, waardoor de hersenen worden beschermd. gezondheid van het zenuwstelsel. Bovendien kan Cistanche deserticola ook de groei en het herstel van zenuwcellen bevorderen, waardoor de connectiviteit en functie van neurale netwerken wordt verbeterd. Deze effecten kunnen het geheugen, het leervermogen en de denksnelheid helpen verbeteren, en kunnen ook de ontwikkeling van cognitieve stoornissen en neurodegeneratieve ziekten voorkomen.

Klik op Know om het kortetermijngeheugen te verbeteren

De "x"-waarde werd als volgt bepaald: het aftrekken van het "x"-gevouwen Hsp60-signaal van het mitochondriale DNA-signaal in de controlegroep maakte de mitochondriale DNA-waarde kleiner dan of gelijk aan nul. Het signaal van histon H2B werd vermenigvuldigd met "y".

De "y"-waarde werd als volgt bepaald: het aftrekken van het "y"-gevouwen histon-H2B-signaal van het nucleaire DNA-signaal in de controlegroep maakte de nucleaire DNA-waarde kleiner dan of gelijk aan nul. Als het achtergrondsignaal hoog wordt door de vermenigvuldiging, kan het contrast van het vermenigvuldigde beeld worden aangepast voor dezelfde omstandigheden in alle monsters.

Het beeld van dsDNA-kleuring, minus het aangepaste beeld van vermenigvuldigd Hsp60 en histon H2B, werd gebruikt voor daaropvolgende analyse. Met behulp van de functie "Adjust-Threshold" werden deze afbeeldingen gebinariseerd. We selecteerden dsDNA-puncta variërend in grootte van 2 tot 20 µm2 (circulariteit 0,1–1,0), en ze werden geteld met behulp van de functie "Analyze-Analyze Particles".

2.3. Elektronenmicroscopie

Eén dag vóór de transfectie werden HeLa-cellen uitgeplaat met een dichtheid van 600 cellen/μL. De expressie van interessante genen werd tot zwijgen gebracht in HeLa-cellen met behulp van Stealth RNAi siRNA (Thermo Fisher Scientific) in Lipofectamine RNAiMAX Transfectiereagens (ThermoFisher Scientific) volgens de instructies van de fabrikant (met een uiteindelijke RNA-concentratie van 10 nM).

Vier dagen na de knockdown van siRNA werden de cellen onderworpen aan fixatie. Celkweekmonsters werden gefixeerd met 2% PFA en 2% glutaaraldehyde in 0.1 M fosfaatbuffer, pH 7,4, bij 37 ◦C, en vervolgens in een 4 ◦C koelkast gedurende 30 minuten. De monsters werden een nacht bij 4 ◦C gefixeerd in 2% glutaaraldehyde in 0.1 M fosfaatbuffer. De monsters werden driemaal gewassen met 0.1 M fosfaatbuffer gedurende 30 minuten en daarna 1 uur bij 4 ◦C gefixeerd met 2% osmiumtetroxide in 0,1 M fosfaatbuffer.

De monsters werden gedehydrateerde, ingegradeerde ethanoloplossingen, overgebracht naar hars (Quetol-812, Nisshin EM Co., Tokyo, Japan) en 48 uur bij 60 ◦C gepolymeriseerd. De gepolymeriseerde harsen werden in ultradunne 70-nm-secties gesneden met een diamantmes met behulp van een ultramicrotoom (Ultracut UCT, Leica Microsystems, Wetzlar, Duitsland) en werden vervolgens op koperen roosters gemonteerd.

De secties werden 15 minuten bij kamertemperatuur gekleurd met 2% uranylacetaat en gewassen met gedestilleerd water, gevolgd door secundaire kleuring met een loodkleuringsoplossing (Sigma-Aldrich, Tokyo, Japan) bij kamertemperatuur gedurende 3 minuten.

De roosters werden waargenomen onder een transmissie-elektronenmicroscoop (JEM-1400Plus, JEOL Ltd., Tokyo, Japan) bij een versnellingsspanning van 80 kV (zebravishersenen) of 100 kV (cel), en de beelden werden opgenomen met behulp van een CCD-camera (Charge-Coupled Device) (EM-14830RUBY2,JEOL Ltd.) .

2.4. Immuno-elektronenmicroscopie

De monsters op de gouden schijven werden bevroren in vloeibaar propaan bij −175 ◦C. Nadat de monsters waren ingevroren, werden ze gedurende 24 uur bij -80 ◦C gevriessubstitueerd met 1% looizuur in ethanol en 2% gedestilleerd water.

De monsters werden vervolgens 4 uur bij -20 ◦C gehouden, gevolgd door 1 uur incubatie bij 4 ◦C. Vervolgens werden de monsters driemaal gedurende 30 minuten gedehydrateerd in watervrije ethanol. elke keer, gevolgd door infiltratie met een 50:50 mengsel van ethanol en hars (LR white: London Resin Co. Ltd., Berkshire, VK) bij 4 °C gedurende 1 uur. De monsters werden overgebracht naar verse 100% hars en gedurende 30 minuten bij 4 ◦C geïncubeerd, en dit proces werd drie keer herhaald.

De monsters werden overgebracht naar verse 100% hars en werden gepolymeriseerd bij 50 ◦CO/N. De gepolymeriseerde harsen werden ultradunne secties gemaakt bij 90 nm met een diamantmes met behulp van een ultramicrotoom (Ultracut UCT; Leica), en de secties werden op nikkelroosters geplaatst. De roosters werden geïncubeerd met anti-dsDNA-antilichaam (35I9 DNA) (1/800, Abcam, Cat# ab27156, RRID: AB_470907) in 1% BSA/PBS bij 4 ◦CO/N, gevolgd door drie spoelingen met 1% BSA/PBS gedurende elk 1 minuut.

Ze werden vervolgens gedurende 2 uur bij kamertemperatuur geïncubeerd met het secundaire antilichaam geconjugeerd aan {{0}} nm gouddeeltjes (geit anti-muis IgG polyklonaal antilichaam). Na spoelen met PBS werden de roosters in 2% glutaaraldehydeine 0,1 M cacodylaatbuffer geplaatst.

Daarna werden de roosters gedroogd en vervolgens 15 minuten gekleurd met 2% uranylacetaat en 3 minuten bij kamertemperatuur met een loodkleuringsoplossing (Sigma-Aldrich). De roosters werden bekeken door een transmissie-elektronenmicroscoop (JEM-1400 plus; JEOLLtd.) bij een versnellingsspanning van 100 kV. Digitale beelden zijn verkregen met een CCD-camera (EM-14830RUBY2, JEOL Ltd.).

3. Resultaten

3.1. Verminderde TFAM of GBA induceert een toename van ectopisch mitochondriaal DNA

Eerst lieten we een voorbeeld zien van de detectie van cytoplasmatisch DNA uit mitochondriën in HeLa-cellen waarin het TFAM-eiwit werd afgebroken door siRNA (Figuur 1A). TFAM is een belangrijke mitochondriale transcriptiefactor en functioneert ook bij de replicatie en reparatie van mitochondriaal DNA [20]. .

Er wordt gerapporteerd dat sequentiepolymorfismen in dit gen geassocieerd zijn met de ziekte van Parkinson [21,22]. Na drie dagen knockdown van het TFAM-eiwit werden veel dubbelstrengige DNA-stippen gedetecteerd in het cytoplasma van de HeLa-cellen.

Histones zijn positieve markers voor DNA van nucleaire oorsprong in het cytoplasma, en negatieve markers voor mitochondriaal DNA en DNA van mitochondriale oorsprong in het cytoplasma [23]. Deze stippen waren niet co-lokaliseerd met histonen, wat suggereert dat ze geen nucleair afgeleid DNA waren. Bovendien lokaliseerden sommige van deze cytoplasmatische, ectopische DNA-stippen niet samen met Hsp60, een marker voor de mitochondriale matrix, wat aangeeft dat ze zich buiten de mitochondriën bevonden (Figuur 1B, C).

Elektronenmicroscopie toonde ook aan dat het ectopische DNA uit de mitochondriën lekte (Figuur 2A, B). Samenvattend was de toename van ectopische DNA-dots in het cytoplasma door TFAM-knockdown te wijten aan het lekken van mitochondriaal DNA uit de mitochondriën. Ten tweede lieten we een ander voorbeeld zien van de detectie van van mitochondriën afkomstig cytoplasmatisch DNA in HeLa-cellen waarin GBA-eiwit werd afgebroken door siRNA (Figuur 1A).

GBA is het veroorzakende gen voor de ziekte van Gaucher, maar een heterozygote mutatie van GBA is ook een risicofactor voor de ziekte van Parkinson [24]. Er werden veel dubbelstrengige DNA-stippen gedetecteerd in het cytoplasma van de HeLa-cellen na 3 dagen knockdown van het GBA-eiwit. Sommige DNA-stippen waren samen met histonen gelokaliseerd, wat erop wijst dat het nucleair afgeleid DNA was.

Andere DNA-stippen waren niet gecolokaliseerd met histonen, wat suggereert dat het geen nucleair afgeleid DNA was, maar van mitochondriën afgeleid DNA (Figuur 1D). Samenvattend was de toename van het aantal ectopische DNA-stippen in het cytoplasma door GBA-knockdown op zijn minst gedeeltelijk te wijten aan het lekken van mitochondriaal DNA uit de mitochondriën.

For more information:1950477648nn@gmail.com