Deel Ⅰ: Nierorganoïden gegenereerd uit erytroïde voorlopercellen van patiënten met autosomaal dominante polycystische nierziekte

voor meer informatie:ali.ma@wecistanche.com

Roberta Faciolio, Fernando Henrique Lojudice, & et al.

Invoering

Autosomaal dominante polycysteusnierziekte(ADPKD) is de meest voorkomende genetische oorzaak van chronische nierziekte (CKD) wereldwijd, en het is een van de meest voorkomende erfelijke monogene aandoeningen, die een populatie treft die wordt geschat op 1:400-1000 [1].ADPKD (autosomaal dominante polycysteusnierziekte) wordt veroorzaakt door mutaties in de genen PKD1 (type 1 polycystische nierziekte) en PKD2 (type 2 polycystische nierziekte), die coderen voor respectievelijk polycystine-1(PC1) en polycystine-2 (PC2), resulterend in cilia veranderingen en cystevorming. Beide eiwitten moduleren talrijke moleculaire routes evenals weefselmorfogenese en functie. De exacte moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan cystogenese blijven echter onduidelijk. Het is algemeen aanvaard dat een kiembaanmutatie gevolgd door een somatische mutatie (tweede treffer) in het normale allel noodzakelijk is voor cystogenese [2,3]. Bovendien is op basis van resultaten van orthologe muismodellen aangetoond dat een extra nierinsult (derde treffer) nodig is voor snelle en ernstige cystegroei in rijpe nieren [4,5]. Het lijkt erop dat bij mensen de meeste tweede treffers optreden tijdens de ontwikkeling van de nieren, wat leidt tot cystische vorming en groei, zelfs in utero. Daarom kunnen de ernst en de snelheid van progressie van nierziekte als gevolg van PKD1 (type 1 polycystische nierziekte) en PKD2 (type 2 polycystische nierziekte) mutaties worden beïnvloed door verschillende factoren, waaronder de timing van inactivatie van de genen, nierontwikkelingsstoornissen stadium, omgevingsinvloeden, aanwezigheid van gelijktijdige nierlaesies en diversiteit van genetische mutaties.

Hoewel er talloze gegevens zijn over de pathofysiologische mechanismen van ADPKD (autosomaal dominante polycystischenierziekte) verzameld uit onderzoeken met orthologe en niet-orthologe muismodellen, zijn er slechts een handvol onderzoeken die zich richten op menselijke cellulaire modellen van cystogenese [6]. In 2007 herprogrammeerden Takahashi et al. [Z met succes somatische cellen in pluripotente stamcellen met embryonale eigenschappen, en noemden ze "geïnduceerde pluripotente stamcellen" (iPSC's). Sindsdien zijn veel somatische celbronnen geherprogrammeerd in iPSC's (geïnduceerde pluripotente stamcellen) van dierlijke of menselijke weefsels (hiPSC's) [Z], waarbij volwassen fibroblasten de belangrijkste bron van de laatste vertegenwoordigen. In 2013 Freedman et al.[8] geïnduceerde hiPSC's (geïnduceerde pluripotente stamcellen) van de fibroblasten van ADPKD (autosomaal dominante polycystischenierziekte) patiënten en vonden verminderde ciliaire expressie van polycystine-2, wat het gebruik van dergelijke cellen ondersteunt om polycystische ziekte (PKD) pathofysiologie te onderzoeken. Meer recent meldden Chen et al. in 2016 dat ze hiPS-cellen hadden verkregen uit erytroïde voorlopercellen [9].

De afgelopen jaren is er aanzienlijke vooruitgang geboekt bij het genereren van 3-dimensionale organoïden uit iPSC's (geïnduceerde pluripotente stamcellen) [Z,10-12]. primairniertubulaire epitheliale organoïden kunnen worden afgeleid van nierweefsel, evenals van urine, en deze organoïden zijn een belangrijk hulpmiddel voor gepersonaliseerde ziektemodellering, zoals aangetoond door Schutgens et al. [13].In latere studies, Freedman et al.[14] konden genererennierorganoïden afgeleid van een in de handel verkrijgbare hiPS-cellijn, waarmee een protocol wordt opgesteld om de celtypen te genereren die aanwezig zijn in de meta-nefrische massa die aanleiding geven tot alle structuren van het nefron. Vervolgens, door de PKD1 (type 1 polycysticnierziekte) of PKD2 (type 2 polycystische nierziekte) genen, observeerden deze onderzoekers cystevorming vannierbuisjes. Met het oog op al deze geavanceerde en innovatieve technologieën, wilden we iPSC's (geïnduceerde pluripotente stamcellen) verkrijgen uit de circulerende erytroïde voorlopercellen van ADPKD (autosomaal dominante polycystischenierziekte)patiënten en test de ontwikkeling van nierorganoïden in vitro om de stappen die betrokken zijn bij organogenese te recapituleren, in een poging enkele pathofysiologische gebeurtenissen op te roepen die verband houden met vroege cystogenese.

Klik om bijwerkingen en voordelen voor de nieren te verwijderen

Methoden Patiëntselectie

Er werden bloedmonsters afgenomen van twee niet-verwante vrouwelijke patiënten (PT1 en PT2) die klinisch gediagnosticeerd waren met ADPKD (autosomaal dominante polycystische nierziekte) (PT1:66 jaar oud, eGFR 43,8 ml/min per 1,73 m2 en PT2:56 jaar oud, eGFR 60,2 ml/ min per 1,73 m2), gevolgd bij de Polycystic Kidney Disease. Polikliniek van de afdeling Nefrologie van de Federale Universiteit van Sao Paulo (UNIFESP) en een ander monster werd verzameld van een gezonde vrouw, die diende als controle om de techniek te stabiliseren en te normaliseren. De ADPKD-diagnose (autosomaal dominante polycystische nierziekte) was gebaseerd op een positieve familiegeschiedenis en op de aanwezigheid van niercysten, volgens de ultrasonografische diagnostische criteria van Pei et al. [15]. (Familiestambomen worden weergegeven in S1A Fig). Beide patiënten hadden cystische nieren en levers (Magnetic Resonance Images worden weergegeven in S1B Fig). De studie is beoordeeld en goedgekeurd door de ethische adviescommissie van de universiteit (CEP UNIFESP, "Comite de Etica em Pesquisa da Universidade Federal de Sao Paulo", Nr.1199.-0079-10/2018). Na een interview om het doel van het onderzoek uit te leggen, ondertekenden zowel de patiënten als de gezonde controle het formulier voor geïnformeerde toestemming.

Uitbreiding van erytroïde voorlopercellen geïsoleerd uit volbloed Bloedmonsters werden verzameld in een vacutainerbuis die EDTA (als een anticoagulans) bij kamertemperatuur bevatte. Erytroïde voorlopercellen (EP) werden vervolgens gescheiden door middel van een RosetteSep-methode (15216; Stem Cell Technologies), die ongewenste cellen, zoals rijpe RBC's en bloedplaatjes, verwijderde terwijl de gewenste EP-populatie behouden bleef. Vanwege de lage concentratie EP's in volbloed werden de cellen geëxpandeerd en gekweekt in een specifiek kweekmedium dat cytokinen en supplementen bevat (X-Vivo-medium, Lonza). EP-cellen werden geïdentificeerd door flowcytometrie met behulp van de transferrinereceptor (CD71) en glycophorine A (Gly A) als markers gelabeld met GFP (S2 Fig).

Herprogrammering van erytroïde voorlopercellen

Uitgebreide EP-cellen werden verzameld en genucleofecteerd met behulp van een Epi5 Episomal iPSC (geïnduceerde pluripotente stamcellen) herprogrammeringskit (Thermo Fisher) met een geoptimaliseerd mengsel van vijf herprogrammeringsfactoren (okt-4, Sox2, Lin28, L-Myc, en Klf4). Transfectie (elektroporatie) werd uitgevoerd met episomale vectoren (virusvrij, niet-integrerend) uit een Lonza Nucleo-factorkit. Na transfectie werden cellen uitgeplaat in ReproTeSR-specifiek kweekmedium voor herprogrammering (Stem Cell Technologies) onder standaard celkweekomstandigheden (37C, 95 procent CO en 5 procent O).

Karyotypering

Om te verifiëren of het herprogrammeringsproces de chromosomale integriteit behield, werd karyotype-analyse uitgevoerd op de Genetische Afdeling van UNIFESP. Cellen werden behandeld met 100 ul colchicine (0,08ug/ml) in 5 ml iPs celkweekmedium om het stoppen van de celcyclus te induceren, gevolgd door de toevoeging van een 0,075 M hypotone KCl-oplossing om nucleaire zwelling te induceren; cellen werden vervolgens gefixeerd met een mengsel van methanol en azijnzuur (3:1). Metafase-chromosomen werden geoogst en Wright-kleuring werd gebruikt voor de cytogene analyse van G-banden (S3 Fig).

iPSC (geïnduceerde pluripotente stamcellen) koloniekarakterisering

EP-cellen werden geherprogrammeerd door episomale vectoren, vormden typische iPSC-kolonies (geïnduceerde pluripotente stamcellen) en vertoonden een normaal karyotype (S3 Fig). De iPSC (geïnduceerde pluripotente stamcellen) koloniekenmerken werden vergeleken met die van een gevestigde controle afgeleid van de H9-lijncel (hESC, Human Embryonic Stem Cells, WA09, verkrijgbaar bij het Wicell Research Institute, VS)( Afb. 1B). Omdat de iPSC's (geïnduceerde pluripotente stamcellen) een typische morfologie vertoonden, werden de pluripotentiemarkers geïdentificeerd door middel van immunofluorescentie. Cellen werden gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur gefixeerd met 4% paraformaldehyde. Na fixatie werden de monsters driemaal gewassen met PBS, geblokkeerd in 5 procent PSA en 0,3 procent Triton-X-100/DPBS en overnacht geïncubeerd met primaire antilichamen (Cell Signaling, Ma, EUA), namelijk OCT4(1 :400 verdunning) als een test van pluripotentie. De volgende dag werd een nieuw glaasje bereid, gewassen in PBS en geïncubeerd met een Alexa Fluor secundair antilichaam (1:200 verdunning, celsignalering) en DAPI (1:1000, Invitrogen, MA, VS) werd toegevoegd voor nucleaire identificatie.

Fig 1. Generatie en karakterisering van iPSC's(geïnduceerde pluripotente stamcellen). iPSC's werden geherprogrammeerd van geëxpandeerde erytroïde voorlopercellen (EP) van een gezonde controle (HC) en twee verschillende ADPKD-patiënten (PT1 en PT2).

A. Schematische stapsgewijze generatie van nierorganoïden B. Gelijkenis van iPSC (a. typisch beeld van iPSC van de commerciële H9-embryocellen. b. iPSC van voorlopercellen van erytroïde cellen van de gezonde controle)

C. Morfologie van iPSC-kolonies D. Karakterisering van iPSC-pluripotentie waargenomen onder een omgekeerde digitale fluorescentiemicroscoop van EVOS fl.

OCT4-antilichaamlabeling werd gebruikt als een pluripotentiemarker om de pluripotentieaard van de HC-, PT1- en PT2-kolonies te karakteriseren.

Celkernen werden gelabeld met DAPI (schaalbalk voor figuur 1B: 200 m; schaalbalk voor figuur 1C: 1000 m; schaalbalk HC / PT2 voor figuur 1D: 1000 m; schaalbalk PT1 voor figuur 1D: 200 m).

Het vermogen van iPSC's (geïnduceerde pluripotente stamcellen) om te differentiëren in alle drie de kiemlagen

iPSC's (geïnduceerde pluripotente stamcellen) werden gekweekt in 6-well-platen bedekt met Matrigel (1:10, BD Biosciences, NY, EUA) in mTeSR1-kweekmedium (Stem Cell Technologies, BC, Canada). Om te voorkomen dat de iPSC's (geïnduceerde pluripotente stamcellen) differentiëren, werden de kolonies handmatig gepasseerd door mechanische fragmentatie met een pipetpunt onder een microscoop, of ze werden gedissocieerd door enzymatische spijsvertering met behulp van Gentle Cell (Life Technologies) (S4 Fig). Met behulp van deze methoden werden iPSC's (geïnduceerde pluripotente stamcellen) gedurende 22 seriële passages gehandhaafd om ervoor te zorgen dat cellen de herprogrammeringsfactoren op de juiste manier verwerkten. De iPSC's (geïnduceerde pluripotente stamcellen) werden vervolgens gestimuleerd om te differentiëren in de drie kiemlagen met behulp van een STEMdiff Trilineage Differentiation-kit (Stem Cell Technologies). Na vijf dagen werden cellen geoogst voor analyse van lijnleeftijdspecifieke markers van mesoderm en endoderm, en na zeven dagen werden ze geanalyseerd op ectoderm, volgens het STEMdiff Trilineage Differentiation-protocol (S5 Fig).

Moleculaire karakterisering van alle drie de kiemlijnen door qRT-PCR

Totaal RNA uit kweken van de drie kiemlagen werd geëxtraheerd met behulp van een GE RNA Spin Mini-kit (GE Healthcare, VS) en vervolgens omgezet in cDNA met behulp van een High Capacity Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems, VS) volgens de instructies van de fabrikant. Kwantitatieve realtime PCR (gRT-PCR) werd uitgevoerd met behulp van een SYBR Green PCR-kit (Applied Biosystems, VS) volgens het protocol van de fabrikant. mRNA-expressieniveaus werden berekend met behulp van de 2 ^ Ct-methode. Hydroxymethylbilaansynthase (HMBS) en glyceraldehyde 3-fosfaatdehydrogenase (GAPDH) werden gebruikt als interne controles en de expressie van OCT4 werd gebruikt als kwantitatieve controle. De expressie van SOX17 werd gebruikt om differentiatie tot endoderm te identificeren, CXCR4 werd gebruikt om differentiatie in het mesoderm te identificeren en PAX6 werd gebruikt om differentiatie tot ectoderm te identificeren (S6 Fig). Alle primersequenties zijn gespecificeerd in S1-tabel en de efficiëntiecurve werd geëvalueerd voor elk primerpaar.

Immunofluorescentie voor de verschillende kiemlagen

iPSC's (geïnduceerde pluripotente stamcellen) werden geïnduceerd om te differentiëren op dekglaasjes in platen met zes putjes. Na differentiatie werden de dekglaasjes uit de oorspronkelijke putjes verwijderd en overgebracht naar een nieuwe plaat, waar de cellen werden gefixeerd met 4% paraformaldehyde en vervolgens gewassen met PBS, zoals hierboven beschreven. Primaire antilichamen tegen OCT4 (1:400; celsignalering), CXCR4 (1; 100; celsignalering), PAX6 (1: 100; Thermo Fisher) en SOX17 (1: 100; R & D-systemen) werden gebruikt. Fluorescentie werd beoordeeld met behulp van een Alexa Fluor secundair antilichaam (1:200; celsignalering).

Nierorganoïde differentiatie van iPSC's (geïnduceerde pluripotente stamcellen)

Renalorganoïden werden gegenereerd volgens het protocol beschreven door Cruz et al. [6] met enkele aanpassingen. In het kort werden 50,000 iPSC's (geïnduceerde pluripotente stamcellen) van de HC en twee ADPKD-patiënten (autosomaal dominante polycystische nierziekte) gebruikt om suspensies van afzonderlijke cellen te produceren met Accutase-onthechtingsoplossing (Stem Cell Technologies). Enkele cellen werden aangevuld met 10 uM Rho-kinaseremmer (Y27632, Stem Cell Technologies of Stemgent). Na 16 uur werd het kweekmedium vervangen door 1 ml mTeSR1 plus 2,5 procent Matrigel plus 10 uM Y27632. Na 20 uur werd het medium vervangen door alleen 1 ml mTeSRI; 14 uur later werd het kweekmedium vervangen en werden cellen geïnduceerd met 6 uM CHIR99021 (AT104; Stamcel of Stemgent GSK-3b-remmer/Wnt-pathway-agonist) plus Advanced RPMI (Thermo Fisher) plus Glutamax (Life Technologies) plus 10 ug/ml antibioticum (ampicilline; 1:1000; Gibco ). Uiteindelijk, 36 uur later, werd het kweekmedium vervangen door DRB-medium dat Advanced RPMI (Thermo Fischer) plus Glutamax (Thermo Fischer) plus B27 Supplement (17504-044; Life Technologies) plus antibioticum bevat. Het DRB-medium werd 28 dagen lang elke drie dagen ververst. Deze periode (28 dagen) was voldoende om de organoïden door microscopie zichtbaar te maken.

Moleculaire karakterisering van organoïden door RT-PCR

Semi-kwantitatieve genexpressie werd geëvalueerd door middel van RT-PCR tijdens het embryogene proces, waarbij totaal RNA werd gezuiverd uit de celstructuren gevormd op dagen 0(iPSC's (geïnduceerde pluripotente stamcellen)) en op 14,21, 28 en 35 dagen na differentiatie-inductie. De expressie van WT1 (nier in ontwikkeling), AQP1 (proximale buis) en ECAD (cyste-epitheelmarker) werd geëvalueerd. GAPDH werd gebruikt als interne controle. De expressie van OCT4 werd gebruikt als een kwantitatieve standaard.

Resultaten

Het verkrijgen van iPSC's (geïnduceerde pluripotente stamcellen) van erytroïde voorlopers (EP's)

Het protocol dat wordt gebruikt om nierorganoïden te verkrijgen van erytroïde voorlopers is samengevat. Uitbreiding van EP's resulteerde in cellen van 1x10 graden na ongeveer 20 dagen (S2A Fig), en ongeveer twee maanden later werden EP's geïdentificeerd door hun expressie van de markers CD71 en Gly A. De efficiëntie van de scheidingsmethode onthulde expressie; 88 procent van de cellen waren CD71-positief en 57,4 procent was Gly A-positief (S2BFig).

Nadat was geverifieerd dat de cellen EP's waren, werden ze getransfecteerd met herprogrammeringsfactoren (oktober-4, Sox2, Lin28, L-Myc en klf4) en werden ze vervolgens bewaard in een specifiek medium voor herprogrammering (ReproTeSR, Stem Cell Technologies) voor ongeveer vijf dagen. iPSC's (geïnduceerde pluripotente stamcellen) ontwikkelden typische cellulaire kenmerken door kolonies te vormen met een morfologie die verschilt van die van niet-geherprogrammeerde cellen die in dezelfde celcultuur aanwezig zijn. Cellen werden gevolgd totdat we typische iPSC (geïnduceerde pluripotente stamcellen)-achtige kolonies observeerden die vergelijkbaar waren met de kolonies van commerciële H9-cellijn (Eig 1B). iPSC (geïnduceerde pluripotente stamcellen) kolonies werden ook herkend door hun relatief grotere omvang, strakke celverpakking, goed gedefinieerde homogene vorm en regelmatige randen. Identificatie werd vergemakkelijkt door de lage mate van kolonie-overgroei van gedifferentieerde cellen in een feedervrij herprogrammeringsmedium (Eig 1C). Er werden geen detecteerbare verschillen gevonden tussen iPSC-kolonies van de HC- en ADPKD-patiënten (Autosomaal dominante polycystische nierziekte) (PTl en PT2) in termen van koloniemorfologie en pluripotentiemarkers, zoals weergegeven in figuur 1D.

iPSC's (geïnduceerde pluripotente stamcellen) werden verder gekenmerkt door hun vermogen om te differentiëren in de drie kiemlagen. Typische beelden van de progressie van kiemlaagontwikkeling in cellen van de HC worden getoond in S5 Fig. De ontwikkeling van de drie kiemlagen werd geverifieerd door typische morfologie (Eig 2A) en door immunofluorescentielabeling voor differentiatiemarkers, namelijk FOXA2 voor endo-derm , gladde spieractine (SMA) voor mesoderm en SOX2 voor ectoderm (Eig2B-2D). Negatieve controles voor de antilichamen worden getoond in S7 Fig. Fig. 2E toont de genexpressieniveaus van specifieke markers van endoderm (SOX17), mesoderm (CXCR4) en ectoderm (PAX6), zoals gedetecteerd door RT-PCR.

Fig 2. Karakterisering van de drie kiemlagen. Gezonde controle (HC) en ADPKD1-patiënten (PT1 en PT2).

A. Typische morfologie van de drie kiemlagen. Kiemlagen werden gekenmerkt door immunofluorescentiekleuring met behulp van specifieke antilichamen. B. Endoderm (FOXA2),

C. Mesoderm (SMA) en D. Ectoderm (SOX2). Celkernen werden gekleurd met DAPI. De laatste kolommen tonen samengevoegde afbeeldingen.

E. Genexpressie van OCT4 geeft pluripotentie van iPSC's aan, SOX17 was een marker voor endoderm, CXCR4 was een marker voor mesoderm en PAX6 was een marker voor ectoderm (n=2).

OCT4-expressie door iPSC's werd gebruikt als een interne kwantitatieve controle. OCT4-expressie was niet detecteerbaar in cellen van de drie kiemlagen (schaal: 200 m).

Generatie van nierorganoïden uit iPSC's (geïnduceerde pluripotente stamcellen)

Driedimensionale nierstructuren werden gegenereerd uit iPSC's (geïnduceerde pluripotente stamcellen) afgeleid van de HC- en beide ADPKD-patiënten (autosomaal dominante polycystische nierziekte) volgens stappen die de embryonale ontwikkeling recapituleren. Fig 3 toont de stappen die nodig zijn om de respectieve embryonale structuren te verkrijgen. iPSC (geïnduceerde pluripotente stamcellen) kolonies (Eig 3A) werden gedissocieerd met Accutase (Fig 3B) om enkele iPSC's (geïnduceerde pluripotente stamcellen) te verkrijgen (Fig3C). Gezien het normale embryogene proces, zou verwacht worden dat de kolonies differentiëren in een blastula en vervolgens een gastrula, maar de spontane differentiatie van iPSC's (geïnduceerde pluripotente stamcellen) in kweek is nog steeds een uitdaging, aangezien cellen spontaan apoptose ondergaan [16]. Om dit ongewenste resultaat te omzeilen, werd 16 uur na de eencellige fase een ROCK-remmer van signalering （10μM Rho-kinaseremmer Y27632） toegevoegd. Remming van de ROCK-route voorkomt dat cellen de doodsroutes activeren, waardoor ze kunnen overleven en zich kunnen aanpassen om door te gaan naar het differentiatieproces. De iPSC's (geïnduceerde pluripotente stamcellen) groeiden vervolgens tot ze het epiblaststadium bereikten, dat wordt gekenmerkt door de aanwezigheid van bolvormige holtes (Fig 3D). Vervolgens werd een krachtige GSK-3b-remmer/Wnt-pathway-agonist (CHIR99021) toegevoegd, die werd gevolgd door de toevoeging van DRB-medium om de epitheliale-mesenchymale overgang te induceren (Fig 3E en 3E) en tenslotte de mesenchym-epitheliale overgang ( Fig 3G); deze stappen maakten epithelialisatie en sequentiële vorming van pretubulaire aggregaten en nierblaasjes (Eig 3H) mogelijk, wat uiteindelijk de vorming van niertubulaire organoïden mogelijk maakte (Fig 3D). Al deze in vitro embryogenese-stappen waren vergelijkbaar voor cellen afkomstig van zowel HC- als ADPKD-patiënten (autosomaal dominante polycystische nierziekte).

De aanwezigheid van buisvormige structuren werd geverifieerd door de expressie van specifieke markers door immunofluorescentie: NHE3 en AQP1 voor proximale tubuli (Eig4A) en NPHS2 voor glomeruli (Eig 4B). Daarentegen werd AQP2-labeling niet gedetecteerd (Eig 4B), wat bevestigt dat dit methodologie maakte alleen de ontwikkeling van de metanefrische massa mogelijk, maar niet van de ureterknop. De marker ECAD werd niet gedetecteerd in afwezigheid van forskoline (Fig. 4B).

Om de aanwezigheid van specifieke markers te verifiëren die tot uitdrukking komen tijdens het proces van de ontwikkeling van de voorlopernieren, werden alle monsters (HC, PT1 en PT2) verzameld op vijf punten van het hele differentiatieproces: dag 0(iPSCs(geïnduceerde pluripotente stam cellen)), dagen 14,21,28 en vervolgens op dag 35 (7 dagen na cyste-inductie). Het tijdsverloop van genexpressie onthulde differentiatie tijdens het embryogeneseproces, zoals getoond in Fig. 5A-5C. De pluripotentiemarker OCT4 werd uitgedrukt door iPSC's (dag O), maar de niveaus werden gedurende 14 dagen verlaagd en bereikten zeer lage niveaus na differentiatie. Daarentegen nam de expressie van de specifieke markers van metanefrisch mesenchym (WT1) en proximale tubulus (AQP1) geleidelijk toe toen het differentiatieproces op dag 14 werd gestart en op dag 21 een plateau bereikte. Fig. 5D toont de expressie van ECAD, een cystogenese marker, op dag 35, dwz 7 dagen na cyste-inductie door forskolin. Bij afwezigheid van forskoline was de expressie van ECAD erg laag, zelfs bij ADPKD-patiënten (autosomaal dominante polycystische nierziekte). Toen forskoline werd toegevoegd (dag 28), vertoonden beide patiënten echter verhoogde ECAD-expressie; maar hetzelfde patroon werd niet waargenomen in HC-organoïde die met lage niveaus van ECAD-expressie bleef, zelfs in de aanwezigheid van forskoline.

De aanwezigheid van cysten gevormd uit de organoïden gestimuleerd met forskolin was duidelijk voor ADPKD-patiënten (autosomaal dominante polycystische nierziekte), zoals getoond in Eig6. Het bovenste paneel toont afbeeldingen van de organoïden op dag 28, vóór de toevoeging van forskolin (Eig6Aa). forskolin toont de aanwezigheid van cyste-achtige structuren in monsters van beide patiënten (PT1 en PT2) maar niet in het HC-monster. De aanwezigheid van cysten werd ook geverifieerd door immunofluorescentiekleuring (Fig. 6B). ECAD-labeling werd niet gedetecteerd in de HC-organoïde, maar werd duidelijk waargenomen in de organoïden van beide patiënten. Interessant is dat ook de aanwezigheid van een cyste-lumen kan worden waargenomen.

Fig 3. Generatie van buisvormige organoïden.

Fasecontrastbeelden van het genereren van epitheliale tubulaire nierorganoïden op 28 dagen van iPSC's gegenereerd uit de HC-, PT1- en PT2-groepen. In de eerste 36 uur werden de iPSC's in 3D-cultuur gehouden.

Vervolgens werden ze gedissocieerd, getransformeerd in afzonderlijke cellen en behandeld met Y-27632, wat cellulaire reorganisatie en overleving mogelijk maakte, waardoor epiblastsferoïden werden geproduceerd (d).

Vervolgens werden CHIR99201 en DRB toegevoegd, waardoor de Wnt/-catenine-route werd geactiveerd en differentiatie in buisvormige organoïden (I) mogelijk werd.

De morfologie onder sferoïden afkomstig van ADPKD-patiënten en van een HC-donor is vergelijkbaar. (Schaalbalk voor a en f: 1000 m; schaalbalk voor b, cd, e, g, h en i: 200 m).

KLIK HIER OM DEEL TE NEMENⅡ