De inductie van perifere getrainde immuniteit in de alvleesklier stimuleert antitumoractiviteit om de progressie van alvleesklierkanker onder controle te houden Deel 2

Discussie

Hoewel de handel in -glucaan eerder is gekarakteriseerd, is het specifieke tropisme van -glucaan naar de alvleesklier niet eerder gemeld37. We laten zien dat glucaandeeltjes rechtstreeks in de alvleesklier terecht kunnen komen en ook kunnen worden gefagocyteerd door macrofagen die vervolgens in de alvleesklier terechtkomen. De relatie tussen de peritoneale holte en de alvleesklier is niet goed gedefinieerd, en studies met betrekking tot de pathofysiologie van acute pancreatitis (AP) hebben aangetoond dat peritoneale macrofagen een belangrijke bijdrage leveren aan de ontstekingsreactie in AP, waardoor een verband tussen het peritoneum en de pancreas wordt ondersteund. en de alvleesklier38.

Onze beeldvormingsgegevens laten inderdaad zien dat peritoneale macrofagen die isotoop-gelabelde WGP fagocyteren voornamelijk naar de alvleesklier gaan. Studies naar leverbeschadiging hebben dit model verder ondersteund van een dynamische uitwisseling van cellen tussen de peritoneale holte en vaste organen die onafhankelijk is van de bloedsomloop 39. Samen suggereert dit dat er zelfs in homeostatische omstandigheden een basaal niveau van immuunceluitwisseling bestaat tussen de en peritoneale holte die kan worden benut in de setting van deeltjes-glucaan.

Macrofagen zijn een belangrijk onderdeel van het aangeboren immuunsysteem van het menselijk lichaam en hebben krachtige functies voor het identificeren, fagocyteren en verwijderen van bacteriën en vreemde stoffen. Parodontitis, een chronische infectieziekte die wordt gekenmerkt door tandvleesontsteking en alveolair botverlies, is de belangrijkste oorzaak van tandverlies bij volwassenen. Het is nu duidelijk dat de weefselvernietiging van parodontitis wordt veroorzaakt door de immuunrespons van de gastheer op infectie, en dat macrofagen, als een belangrijk onderdeel van de immuunrespons van de gastheer, een belangrijke rol spelen bij het ontstaan ​​en de ontwikkeling van ontstekingen.

Daarom moeten we de immuniteit in ons dagelijks leven verbeteren. In ons onderzoek ontdekten we dat Cistanche de immuniteit kan versterken. Cistanche toevoegen aan kokend water om Cistanche-thee te maken en het 1-2 keer per dag drinken kan de immuunfunctie van het lichaam versterken omdat het actieve ingrediënten bevat, zoals polysacchariden, flavonoïden, alkaloïden, enz., die de immuunfunctie van het lichaam. Tegelijkertijd kan het toevoegen van Cistanche aan soep of pap, een of twee keer per week, de immuniteit versterken.

Klik om het pure cistanche-product te kennen

Hoewel deze studie deeltjes-glucaan WGP onderzocht, kan het ook interessant zijn om te onderzoeken of oplosbare gist-afgeleide glucaan een vergelijkbaar tropisme en signaalmechanisme in de alvleesklier vertoont. Van deeltjesvormige -glucanen is bekend dat ze direct signaleren via Dectin-1, terwijl wordt aangenomen dat oplosbare -glucanen werken via een CR3-afhankelijke route om hun antitumoreigenschappen uit te oefenen40,41. Eén studie toonde aan dat IP-toediening van oplosbaar glucaan resulteerde in transport naar het perifere bloed en APC's in het peritoneum, de milt en het beenmerg, wat aangeeft dat ondanks de verschillende moleculaire signaleringsmechanismen een vergelijkbaar vermogen om getrainde immuniteit te activeren mogelijk is42. Aangezien onze gegevens echter aangeven dat deze handel Dectin-1-afhankelijk is, kan alleen deeltjes-glucaan rechtstreekse handel naar de pancreas vertonen via zowel deeltjes als oplosbare stoffen die mechanismen van getrainde immuniteit in gang kunnen zetten.

Verder laten eerdere studies die de handel in intraveneus geïnjecteerd oplosbaar glucaan karakteriseren, handel naar de milt, nier en lever zien, hoewel er geen melding wordt gemaakt van tropisme naar de pancreas43. Aangezien niet eerder werd aangenomen dat de alvleesklier een doelwit is van de handel in glucaan, is het niet duidelijk of de alvleesklier eenvoudigweg nooit is bestudeerd of dat er geen sprake is van handel in alvleesklier.

Toekomstige studies zouden de biodistributie van zowel oplosbaar als deeltjesvormig glucaan over verschillende toedieningsroutes moeten onderzoeken.

-Glucaantransport naar de pancreas heeft een multifactoriële invloed op de immuunpopulaties die in de pancreas aanwezig zijn. Ten eerste heeft de aankomst van glucaan in de pancreas een directe invloed op de populaties van immunosuppressieve M2-residente macrofagen die in de pancreas aanwezig zijn en waarvan bekend is dat ze belangrijk zijn bij de bevordering van pancreastumoren. CyTOF- en scRNA-Seq-gegevens toonden een bijna volledige verdwijning van de residente macrofaagpopulatie 7 dagen na WGP-toediening. Interessant is dat het verdwijnen van de residente macrofaagpopulatie direct samenvalt met een wederkerige verschijning van een Ly6Clo-macrofaagpopulatie. Deze Ly6Clo-macrofaagpopulatie draagt ​​vergelijkbare fenotypische markers als de inwonende populatie, maar neigt meer naar een M1-fenotype.

Het is dus waarschijnlijk dat residente macrofagen in contact komen met glucaan dat naar de alvleesklier is gesmokkeld en deze cellen worden opnieuw gepolariseerd, waardoor ze een ander cellulair fenotype aannemen, wat resulteert in de vorming van een uniek cluster. Ten tweede resulteert de aankomst van -glucaan in de alvleesklier in versterkte chemokine/chemokinereceptorsignalering die pro-inflammatoire Ly6CHi-infiltrerende van monocyten afgeleide macrofagen van de periferie naar de alvleesklier infiltreert. Vierentwintig uur na de toediening van WGP blijken de CCL2-spiegels in volledige pancreaslysaten 30-voudig te zijn verhoogd. Dienovereenkomstig laten we zien dat de robuuste -glucan-afhankelijke cellulaire instroom naar de pancreas afhankelijk is van CCR2.

Hoewel we ons concentreren op de dynamiek van het myeloïde compartiment vanwege het waargenomen belang van CCR2/CCL2-signalering, was er een interessante initiële verbetering van cluster 11 op dag 3 en vervolgens verdwenen op dag 7 na WGP-behandeling. Cluster 11 werd gekarakteriseerd als ILC2's op basis van de expressie van verschillende markers zoals KLRG1, IL-5, IL-13 en ICOS. Van ILC2's is bekend dat het langdurige weefselresidente cellen zijn44. Recente studies hebben aangetoond dat activering van lokale ILC2's door weefselspecifieke alarmines hun proliferatie, lymfekliermigratie en bloedverspreiding induceert. Van ILC2's uit verschillende weefsels, zoals de darm en de long, is aangetoond dat ze het bloed binnendringen door extrusie uit deze verstoorde weefsels en migreren naar andere weefsels zoals de lever44-46.

Een dergelijk mechanisme zou de aanvankelijke toename en vervolgens het verdwijnen van ILC2's in de pancreas kunnen verklaren. Gezien het feit dat ILC2's recentelijk betrokken zijn geweest bij de respons van alvleeskliertumoren op immunotherapie47, is meer onderzoek gerechtvaardigd dat de impact van WGP en de initiatie van getrainde immuniteit op de ILC2-populatie van de pancreas onderzoekt.

Hoewel het op gang brengen van een instroom van pro-inflammatoire immuuncellen naar de pancreas op zichzelf belangrijk is, is het de CCR2 plus Ly6CHi die vanuit de periferie infiltrerende monocyt-afgeleide macrofaagpopulaties infiltreert met kenmerken van getrainde immuniteit die de belangrijkste implicaties met zich meebrengt, aangezien de inductie van perifere getrainde immuniteit in de alvleesklier is nog niet gekarakteriseerd. Deze geïnduceerde getrainde immuniteit wordt ook geassocieerd met metabole en epigenetische herprogrammering.

Hoewel bekend is dat CCR2 een belangrijke receptor is bij de rekrutering van monocyten, is dit ook de eerste indicatie dat CCR2-signalering op monocyten een vereiste is voor het tot stand brengen van perifere getrainde immuniteit. Opgemerkt wordt dat CCR2 plus monocyten/macrofagen in verband zijn gebracht met tumormetastase en -progressie48,49. Onze gegevens suggereren echter dat de rekrutering van opnieuw geprogrammeerde, getrainde CCR2 plus monocyten/macrofagen robuuste antitumoreffecten uitoefent.

Dit wordt direct aangetoond door ons mix-experiment waarbij muizen die CCR2 plus myeloïde cellen kregen van WGP-getrainde muizen een significant verminderde tumorbelasting vertoonden in vergelijking met muizen die CCR2- myeloïde cellen kregen van dezelfde getrainde muis.

Aangezien we laten zien dat perifere getrainde immuniteit in de alvleesklier is gevestigd, vragen we of deze cellen kunnen worden gereactiveerd door tumorcellen of hun uitgescheiden factoren. Hernieuwde blootstelling van in vivo WGP-getrainde pancreas-myeloïde cellen aan tumor-geconditioneerde media bleek krachtig een getrainde respons op te wekken. Kalafati et al. toonde onlangs een rol voor granulocyten in getrainde immuniteitsgestuurde antitumormechanismen21, maar gezien hun gebruik van subcutane modellen van kanker, is de momenteel gerapporteerde studie de eerste keer dat suggereert dat myeloïde cellen in een specifiek orgaan kunnen worden getraind om direct te reageren op tumorcellen van datzelfde orgaan.

Het is algemeen bekend dat myeloïde cellen in staat zijn om tumorcellen direct te doden door mechanismen van fagocytose en ROS-productie50-54, en hier laten we zien dat WGP-training de directe antitumorfunctionaliteiten van verbeterde fagocytose van tumorcellen en ROS-gemedieerde cytotoxiciteit aanzienlijk verhoogt. tumor cellen.

Verder, terwijl we benadrukken dat tumor-geconditioneerde media getrainde myeloïde cellen kunnen reactiveren, identificeren we ook een specifieke factor, MIF, in de tumor-geconditioneerde media die betrokken is bij deze activering. Deze gegevens suggereren dat de inductie van getrainde immuniteit zou kunnen deelnemen aan mechanismen van tumor-immunosurveillance. In de vroege stadia van tumorontwikkeling scheiden tumoren bijvoorbeeld oplosbare factoren af ​​die getrainde aangeboren cellen opnieuw kunnen stimuleren, wat leidt tot de uitroeiing van deze tumorcellen.

Vervolgens vertalen we dit begrip van het antitumorpotentieel van de getrainde aangeboren myeloïde cellen die de alvleesklier binnendringen naar orthotope modellen van PDAC, waar we een dramatische afname van de tumorlast en een toename van de overleving van muizen waarnemen die slechts één toediening van WGP. We tonen verder aan dat de cellen die verantwoordelijk zijn voor tumorcontrole voornamelijk getrainde CCR2 plus van myeloïde afgeleide cellen zijn. In tegenstelling tot andere voorgestelde modellen van tumorcontrole die volledig lijken te worden aangedreven door de inductie van centraal getrainde immuniteit in de BM21, wordt in dit model in plaats daarvan de vroege handel in WGP naar de alvleesklier en de resulterende productie van CCL2 in de alvleesklier gerekruteerd. CCR2 plus myeloïde cellen uit de periferie die voornamelijk verantwoordelijk zijn voor de antitumoreffecten. WGP die rechtstreeks naar de alvleesklier gaat, repolariseert ook M2-achtige weefsel-residente macrofagen naar M1-achtige macrofagen die ook de tumorprogressie kunnen remmen.

Hoewel de tumorreductie die werd waargenomen bij muizen geïmplanteerd met KPC-tumoren die waren gemengd met CCR2 plus getrainde cellen significant was, was deze niet zo opvallend als bij muizen die IP WGP kregen. Dit ondersteunt dat de antitumoreffecten van IP WGP tweeledig zijn; de rekrutering van CCR2 plus getrainde anti-tumor myeloïde cellen naar de alvleesklier en de repolarisatie van pro-tumorigene residente macrofagen werken samen om aangeboren antitumorreacties op te wekken die leiden tot verminderde tumorbelasting in modellen van PDAC.

We merken ook de hoge expressie van MHCII op deze getrainde monocyten/macrofagen op, die waarschijnlijk een rol spelen bij de verwerking van tumorantigeen en communicatie met T-cellen om adaptieve immuunresponsen tegen de tumor op te wekken. Interessant genoeg hebben we, hoewel we bevestigden dat deze antitumormechanismen niet afhankelijk zijn van adaptieve immuunresponsen, wel een significante toename waargenomen van CD8 plus T-cellen aanwezig in CCR2 plus gemengde tumoren. Bovendien, aangezien werd waargenomen dat myeloïde cellen in de tumoren hoge niveaus van PD-L1 vertoonden en dat de aanwezigheid van getrainde CCR2 plus-cellen in de alvleesklier CD8 plus T-cellen leek te rekruteren, redeneerden we dat WGP de effecten van anti-antibiotica zou kunnen versterken. -PD-L1 therapie.

Volgens de literatuur had anti-PD-L1 mAb-therapie alleen geen overlevingsvoordeel, terwijl de combinatie van WGP en anti-PD-L1 synergistisch was om betere overlevingsresultaten te produceren dan WGP alleen55. Dit suggereert dat getrainde aangeboren immuuncellen adaptieve immuuncellen in de TME kunnen activeren, maar de immunosuppressieve micro-omgeving moet waarschijnlijk verder worden overwonnen door de bijkomende effecten van anti-PD-L1. Belangrijk is dat ondanks de verbeterde overleving alle muizen uiteindelijk bezweken aan de tumor, dus toekomstig onderzoek naar de optimalisatie van deze behandeling in termen van dosering en het aantal behandelingen is gerechtvaardigd.

Immunosuppressieve myeloïde cellen spelen een cruciale rol bij het ontstaan ​​van de immunosuppressieve TME in PDAC. Hier demonstreren we een vermogen om deze myeloïde cellen in de setting van PDAC te betrekken door de inductie van getrainde aangeboren immuniteit in de pancreas.

Belangrijk is dat we ook laten zien dat het vermogen om getrainde immuniteit in de alvleesklier te initiëren, de therapeutische effecten van immunotherapie versterkt, zoals anti-PD-L1 immuno-checkpoint-blokkadetherapie. Om deze bevindingen verder klinisch toepasbaar te maken, tonen we ook aan dat de inductie van getrainde immuniteit in de adjuvante setting de tumorgrootte kan verkleinen en de overleving kan verlengen. Deze bevindingen benadrukken het potentieel van het gebruik van -glucaan om myeloïde cellen binnen de TME therapeutisch te targeten en benadrukken dat de inductie van perifere getrainde immuniteit in de alvleesklier een consequente rol zou kunnen spelen bij het herprogrammeren van de onderdrukkende TME van PDAC, wat zou kunnen resulteren in een verlenging van het leven van patiënten. gediagnosticeerd met deze dodelijke maligniteit.

methoden

Ethische verklaring.

Alle experimenten met dieren werden uitgevoerd volgens de ethische richtlijnen van de University of Louisville Institutional Animal Care and Use Committee. Experimenten werden uitgevoerd volgens de goedgekeurde protocollen 19471 en 19536.

Muizen.

Bij alle experimenten werden mannelijke en vrouwelijke muizen van zes tot acht weken oud gebruikt. Wildtype (WT) C57BL / 6 J-muizen werden gekocht bij het Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME, VS) of gefokt in de University of Louisville-specifieke pathogeenvrije (SPF) dierenfaciliteit. C57BL/6 Dectin-1 knock-out (Dectin-1−/−) muizen werden eerder beschreven56. CCR2 global knockout-muizen werden gekocht bij Jackson Laboratory. Albino C57BL/6-muizen werden vriendelijk ter beschikking gesteld door Dr. Jonathan Warawa van de Universiteit van Louisville. NOD/SCID/IL2r Null (NSG) muizen werden gekocht bij het Jackson Laboratory. De maximale tumorgrootte toegestaan ​​door de IUCAC was niet meer dan 2000 mm3. Muizen werden dagelijks gecontroleerd op tumorgroei en geëuthanaseerd wanneer de tumorlast de beperkte omvang overschreed. Muizen werden op een 12-uur donker/licht-cyclus gehouden bij kamertemperatuur met gecontroleerde vochtigheid (ongeveer 55 procent).

Alle dieren werden gehuisvest in een barrièrefaciliteit en er werden alleen gezonde muizen gebruikt voor experimenten. Alle muizen waren ten minste 6 weken oud en alle experimenten met dieren werden uitgevoerd in overeenstemming met alle relevante wetten en institutionele richtlijnen van de Rodent Rearing Facility (RRF) en goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) van de Universiteit van Louisville.

Bereiding van -glucaan.

Sterk gezuiverd deeltjesvormig glucaan in de vorm van deeltjesvormige hele glucaandeeltjes (WGP) geïsoleerd uit Saccharomyces cerevisiae werd geleverd door Biothera. Voor gebruik werd WGP voorzichtig gesoniceerd gedurende 15 seconden, twee keer met behulp van een Qsonica Q55-110 Q55 Sonicator (Cole-Parmer) om ervoor te zorgen dat de aggregaten werden gebroken.

Voorbereiding en gebruik van DTAF-WGP.

DTAF (Sigma-Aldrich) bij 2 mg/ml werd gemengd met een suspensie van 20 mg/ml WGP in boraatbuffer (pH 10,8). Dit werd gedurende 8 uur bij kamertemperatuur onder continu mengen geïncubeerd. Na incubatie werd de WGP vijf keer gecentrifugeerd en gewassen met koude steriele endotoxinevrije DPBS (Sigma-Aldrich) of totdat het supernatant geen zichtbare DTAF meer bevatte. De concentratie werd aangepast tot 10 mg/ml in de endotoxinevrije DPBS voor opslag. Ongeveer 1 mg van de DTAF-WGP heeft IP geïnjecteerd in C57BL/6 en Dectin-1-/− muizen en organen werden 3 dagen later geoogst.

Voorbereiding van de 89Zr-WGP.

WGP (100 mg) werd gemengd met DeferoxamineSCN (2,7 mg, in 0,8 ml DMSO) en overnacht gesuspendeerd in 10 ml natriumcarbonaatbuffer (0,1 M, pH 9,4). bij kamertemperatuur in het donker onder zacht schudden. Het met deferoxamine gemerkte WGP werd vervolgens gewassen met gedeïoniseerd water (10 x 40 ml) en 30 mg met deferoxamine gemerkt WGP werd gemengd met 3 mCi 89Zr-oxalaat in 2 ml Tris•HCl-buffer (0,5 M, pH 7,5), en vervolgens geïncubeerd bij 37 oC gedurende 60 minuten onder schudden. De 89Zr-WGP werd vervolgens gecentrifugeerd en gewassen met 3 ml steriel PBS. De radioactiviteit van 89Zr-WGP werd gemeten door een dosiskalibrator en gebruikt voor in vitro en in vivo studies.

Biodistributie en PET/CT-scan met behulp van 89Zr-WGP.

Beeldvorming met positronemissietomografie (PET)/computertomografie (CT) werd uitgevoerd in C57BL/6- en Dectin-1-/−-muizen 48 uur na IP-injectie van 1 mg pure 89Zr-WGP of injectie van 1 × 106 peritoneale macrofagen die samen gekweekt waren met 25 µg/ml 89Zr-WGP gedurende 2 uur en daarna voorzichtig gewassen om overtollig 89Zr-WGP te verwijderen. De muizen werden 15 minuten gescand met een Siemens R4 MicroPET gevolgd door 10 minuten CT-scan. Siemens IAW-software werd gebruikt voor de acquisitie en reconstructie van het PET-signaal, en Siemens IRW-software werd gebruikt voor het samenvoegen en analyseren van de beeldgegevens.

Aan het einde van het beeldvormingsonderzoek werden muizen geëuthanaseerd en werden interessante organen geoogst. Voor biodistributie werd 50 µl perifeer bloed verzameld met behulp van een retro-bulbaire bloedingstechniek. De hersenen, het hart, de longen, de lever, de milt, de nieren, de pancreas, de dikke darm, de dunne darm, de maag, het dijbeen, een stuk huid van de flank van de muizen en de rectus femoris-spier werden geoogst, gewogen en in een 2470 Wizard automatische gammateller (PerkinElmer) om de radioactiviteit van elk weefsel te meten. De CPM-waarden werden berekend met behulp van Prism-software (GraphPad Software, La Jolla, CA).

Alvleesklier verwerking.

Na euthanasie werd de alvleesklier van de muis geoogst en voorzichtig in kleinere stukjes gesneden met behulp van een steriele schaar. Ze werden gesuspendeerd in een buis van 15 ml in compleet medium (RPMI) met 1X digestiebuffer bestaande uit 300 U/ml collagenase I, 60 U/ml hyaluronidase en 80 U/ml DNase (Sigma). Deze werden gedurende 15-20 minuten in een roterende incubator bij 37 graden met 5 procent CO2 geplaatst. De ontsluitingsbuffer werd vervolgens geblust met ijskoud compleet RPMI 1640 en gewassen. Cellen werden door een steriel nylon korffilter van 40 µm geleid en kleine onverteerde stukjes weefsel werden verbrijzeld met behulp van een steriele spuitdop om een ​​eencellige suspensie te genereren. Als er een aanzienlijk aantal rode bloedcellen (RBC's) in het monster aanwezig waren, werd RBC-lysis uitgevoerd door 2 ml steriele 10x ACK (Thermo Fisher Scientific) toe te voegen.

In vivo WGP-toediening.

Muizen kregen een enkele intraperitoneale dosis van 1 mg voorzichtig gesoniceerde WGP, 3 μm polystyreenbolletjes (Sigma-Aldrich) of 3 μm fluorescerende microbolletjes (Polysciences) (allemaal 1 mg in 200 µl steriel PBS) of 200 µl steriel PBS op dag 0. Voor typisch getrainde immuniteitsonderzoeken werden 7 dagen na de initiële IP-dosis muizen geëuthanaseerd met behulp van CO2, en de alvleesklier samen met andere weefsels van belang werd verwijderd en verwerkt. Voor dosistitratiestudies werden 0,5, 1 en 2 mg WGP IP afgeleverd in 200 µl steriele PBS. Voor tijdtitratiestudies werden muizen geïnjecteerd met 1 mg WGP en de alvleesklier werd geoogst na 24 uur, 48 uur, 3, 7, 10, 16 en 30 dagen later.

Ex vivo herstimulatie.

Om het getrainde fenotype van mononucleaire cellen te beoordelen in muizen die ex vivo waren behandeld met WGP of PBS, werden na verwerking van de alvleesklier pancreascelsuspensies uitgeplaat in platen met 24 putjes en gestimuleerd met LPS (10 ng/ml), het supernatant van gekweekte KPC en Pan02. cellen (40 procent) en recombinant MIF (rMIF) (10 ng/ml). MIF was een genereus geschenk van Dr. Robert Mitchell van de Universiteit van Louisville en werd prokaryote bondgenoot uitgedrukt, gezuiverd en opnieuw gevouwen zoals eerder beschreven57. Cellen werden gekweekt in DMEM en geïncubeerd bij 37 graden met 5 procent CO2 gedurende 5-6 uur in aanwezigheid van 1X brefeldin A (BioLegend). De cellen werden vervolgens geoogst met behulp van een celschraper, gewassen, gepelleteerd en vervolgens gekleurd voor intracellulaire cytokine-expressie.

In vitro training en restimulatietest.

Peritoneale macrofagen of gesorteerde CD11b plus cellen van een alvleesklier van een muis werden uitgeplaat in een 24-putjesplaat gedurende 2 uur bij 37 graden en 5 procent CO2 om de hechting van cellen aan de platen mogelijk te maken, waarna de zwevende cellen voorzichtig werden opgezogen. De aangehechte cellen werden voorzichtig gewassen met steriele PBS en vervolgens opnieuw gesuspendeerd in 1 ml DMEM bestaande uit 10 procent FBS en 1 procent penicilline/streptomycine.

Voor de initiële training van cellen werden 25 ug / ml deeltjes WGP, 25 ug / ml 3 μm polystyreen microdeeltjesbolletjes (Sigma-Aldrich) of 100 ul PBS aan het juiste putje toegevoegd en 24 uur geïncubeerd. Na 24 uur werden de putjes voorzichtig gewassen om de initiële stimulus te verwijderen en werd vers DMEM toegevoegd en werden de cellen gedurende 7 dagen bij 37 graden geïncubeerd met 5 procent CO2. Na 7 dagen werd het medium afgezogen en vervangen door vers medium en werden de cellen opnieuw gestimuleerd met LPS (100 ng/ml), het supernatant van KPC- of Pan02-cellen (40 procent), of PBS als controle. Vierentwintig uur na stimulatie werden de supernatanten geoogst en gebruikt in een ELISA voor TNF- en IL-6.

Tumor-geconditioneerde media.

Ongeveer 1 x 106 KPC- of Pan02-cellen werden gekweekt in een plaat met zes putjes in 4 ml volledig DMEM bij 37 graden en 5 procent CO2. Na 3 dagen werden de supernatanten geoogst en in porties bij -80 graden bewaard voor gebruik als een tumor-geconditioneerd medium. Als controle werd de alvleesklier van een C57BL/6-muis verwerkt tot een enkele celsuspensie en 1 x 106 van deze cellen werden gekweekt in een plaat met zes putjes in 4 ml volledig DMEM en bij 37 graden en 5 procent CO2, en supernatanten werden ook na 3 dagen verzameld. Als controle werd de alvleesklier van naïeve muizen verwerkt tot een eencellige suspensie en gedurende 1 dag uitgeplaat in een plaat met zes putjes. Niet-hechtende cellen werden weggewassen en deze cellen werden vervolgens 3 dagen gekweekt en het supernatant werd geoogst.

Overname van peritoneale macrofagen.

Muizen werden geëuthanaseerd en 5 ml steriel RPMI werd in het peritoneum geïnjecteerd met behulp van een 25-gaugespuit. De buik werd gemasseerd om de peritoneale macrofagen vrij te maken. Er werd een kleine incisie gemaakt en een transferpipet werd gebruikt om de suspensie te verwijderen. De peritoneale holte werd vervolgens verschillende keren gewassen met koude RPMI en cellen werden gepelleteerd met 458 x g.

Flowcytometrie.

Eencellige suspensies in PBS met 1 procent FBS werden gedurende 15 minuten bij 4 graden geblokkeerd met murine Fc Block (anti-CD16/CD32). Met fluorochroom gemerkte antilichamen voor levensvatbaarheid (APC/Cy7) en tegen oppervlaktemarkers CD45, CD11b, F4/80, Ly6G, Ly6C, MHCII, CD3, CD4, CD8, NK1.1, Ki67 (Biolegend) en CCR2 (R&D Systems) werden gebruikt. De informatie met betrekking tot alle stroom Abs is samengevat in aanvullende tabel 3. Na 30 minuten incuberen in het donker bij 4 graden werden de cellen gewassen met koude PBS en gefilterd door een 40 µm mesh filter. De monsters werden verkregen met behulp van een FACSCanto II-cytometer (BD Biosciences) en geanalyseerd met behulp van FlowJo-software (Tree Star, Ashland, OR). FACSDiva-softwareversie 6 werd gebruikt in FACSCanto om alle gegevens te verzamelen.

intracellulaire kleuring voor de expressie van cytokines.

Na stimulatie werden cellen gekleurd op de gewenste oppervlaktemarkers zoals hierboven beschreven. De cellen werden vervolgens gewassen met koude PBS en 500 ul fixatiebuffer (Biolegend) werd aan de buizen toegevoegd, kort gevortext en gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur in het donker geïncubeerd. Vervolgens werd ongeveer 1 ml permeabilisatiebuffer (Biolegend) toegevoegd en monsters werden gedurende 5 minuten bij 4 graden bij 458 x g gecentrifugeerd, gevolgd door nog een wasbeurt met 1 ml permeabilisatiebuffer. Cellen werden opnieuw gesuspendeerd in 200 µl permeabilisatiebuffer en cellen werden gekleurd met antilichamen tegen TNF-, Ki67, Granzyme-B, IL12, IL-6 en IFN of de respectieve isotypecontrole overnacht bij 4 graden. Cellen werden vervolgens gewassen, gefilterd en gegevens werden verkregen met behulp van een flowcytometer.

FACS-isolatie van CD11b plus macrofagen voor in vitro training.

De alvleesklier werd verwerkt tot een eencellige suspensie zoals hierboven beschreven. Cellen werden gewassen met 1 ml PBS en geïncubeerd met Fc-blok gedurende 10 minuten bij 4 graden gevolgd door kleuring met vitaliteitskleurstof (APC-Cy7), CD45 (PerCPcy5) en CD11b plus (APC) gedurende 30 minuten bij 4 graden. Cellen werden gewassen met PBS en opnieuw gesuspendeerd in koude MACS Running Buffer (Miltenyi Biotech). Levensvatbaarheid CD45 plus CD11b plus cellen werden gesorteerd met behulp van een FACS Aria III (BD Biosciences). Cellen werden verzameld in 50 procent FBS, 40 procent PBS en 10 procent HEPES (Corning). Na het sorteren werden de cellen gewassen met PBS en vervolgens uitgeplaat voor in vitro training, zoals hierboven beschreven.

ELISA.

Supernatanten van in vitro getrainde cellen samen met standaarden werden geanalyseerd met muriene TNF- en IL{1}} ELISA-kits (BioLegend). De assay werd uitgevoerd volgens de instructies van de fabrikant en alle condities werden in drievoud uitgevoerd. Een ELISA-kit voor rMIF (R- en D-systemen) werd ook gebruikt volgens de instructies van de fabrikant om rMIF te kwantificeren in Pan02- en KPC-tumorgeconditioneerde media en het supernatant van gekweekte onbehandelde alvleeskliercellen. Om histon-modificaties te kwantificeren, werden ELISA-kits (Tri-methylhistone H3K4-kwantificatiekit, Acetyl-histone H3K27-kwantificatiekit, Tri-methylhistone H3K27-kwantificatiekit en totale histon H3-kwantificatiekit) gekocht bij EpiGentek en er werden assays uitgevoerd op basis van de fabrikant. instructies. Lactaat werd gemeten met L-Lactate assay Kit I (Eton Bioscience).

Western blot-analyse.

CD11b plus cellen van PBS-geïnjecteerde of WGP-geïnjecteerde muizen (24 uur) werden gescheiden met behulp van CD11b-microbeads (Miltenyi Biotech). Histon werd geëxtraheerd volgens de instructies van de fabrikant (Active Motif, Inc.) en de eiwitconcentratie werd bepaald met behulp van Bradford-kwantificering. Histon-eiwitten werden gescheiden door SDS-PAGE 15 procent Tris-HCl-gels en overgebracht op PVDF-membranen (Millipore). Het membraan werd geblokkeerd met 5 procent BSA bij kamertemperatuur gedurende 1 uur en overnacht geïncubeerd bij 4 graden met primaire antilichamen waaronder tri-methyl-histone H3 (lys4) konijnen-mAb, acetyl-histone H3 (lys27) XP Konijnen-mAb, tri-methyl -histone H3 (Lys27) konijnen-mAb en histon H3 XP konijnen-mAb (Cell Signaling Technology), vervolgens geïncubeerd met HRP-geconjugeerde secundaire antilichamen (GE Healthcare) bij kamertemperatuur gedurende 1 uur. Het membraan is ontwikkeld met Amersham ECL Prime Western Blotting Detection Reagent (GE Healthcare) en gedetecteerd via Medical Film Processor (Konica Minolta Medical & Graphic). Precision Plus Protein Kaleidoscope Prestained Protein Standards werden gebruikt als een standaard eiwitmarker (Bio-Rad).

qRT-PCR.

Nadat CD11b plus-cellen waren geïsoleerd uit de alvleesklier van de muis in met WGP behandelde en onbehandelde muizen, werden de cellen bewaard in TRIzol. RNA's werden geïsoleerd en omgekeerd getranscribeerd met behulp van de TaqMan Reverse Transcription Reagents (qRTPCR) -amplificatie met behulp van het Bio-Rad MyiQ single-color RT-PCR-detectiesysteem. In het kort werd cDNA geamplificeerd in een 25 µl reactiemengsel bestaande uit SYBR Green PCR-supermix (Bio-Rad), 100 ng complementaire DNA-template en geselecteerde primers (200 nM) met behulp van de aanbevolen cyclusomstandigheden.

H plus E.

Zeven dagen na injectie met PBS/microdeeltjeskorrels of WGP werden de alvleesklieren geoogst en gefixeerd in 4 procent formaline gedurende 1 week, gevolgd door inbedden in paraffine volgens standaardprocedures. In paraffine ingebedde weefsels werden in secties van 5 mm dik gesneden en gekleurd met hematoxyline en eosine (H & E) voor morfologische analyse.

Meting van serumamylase.

Muizenserumamylase werd gemeten met behulp van de Amylase Activity Assay Kit (Millipore Sigma) en werd gebruikt volgens de instructies van de fabrikant. Kortom, muizen werden geïnjecteerd met WGP en 7 dagen later werd bloed afgenomen bij muizen met behulp van een retro-bulbaire bloedingstechniek. Deze monsters werden gebruikt om te testen op serumamylase.

In vivo uitputting van T-cellen.

T-cellen werden verarmd met behulp van een anti-CD4 mAb alleen, antiCD8 mAb alleen, of anti-CD4 en anti-CD8 mAb's samen. Antilichamen werden in eigen huis gemaakt. Bij deze uitputtingsprocedure hebben muizen IP geïnjecteerd met WGP op dag 1 en werden ook IP geïnjecteerd met 200 µg van de mAb's op dag 1 en dag 4 tijdens de behandelingsperiode. Muizen werden geëuthanaseerd op dag 7. (CD4-kloon GK1.5, CD8-kloon 53-6.72). Depletie-efficiëntie werd bevestigd op dag 7.

In vivo uitputting van NK-cellen.

NK-cellen werden uitgeput door de intraperitoneale injectie van 100 µg PK136 mAb (geproduceerd in het laboratorium van Dr. Jun Yan aan de Universiteit van Louisville) op dag −1 en 5 tijdens de behandelingsperiode. WGP werd op dag 0 geïnjecteerd en op dag 7 werden de dieren geëuthanaseerd en de uitputtingsefficiëntie van NK-cellen werd beoordeeld door pancreasweefsels te kleuren voor NK1.1.

Ly6G-uitputting.

Neutrofielen werden uitgeput door 300 µg anti-Ly6G mAb (Bio X Cell) of isotype controle Rat IgG2a (Bio X Cell) te injecteren op dag −1, 2 en 6 tijdens de behandeling. Ongeveer 1 mg WGP injecteerde IP op dag 1. Muizen werden op dag 7 geëuthanaseerd en de alvleesklier werd beoordeeld op efficiëntie van uitputting. In de tumor werden modelmuizen geïnjecteerd met 300 µg anti-Ly6G mAb of isotypecontrole Rat IgG2a op dagen -2, 4, 10 en 16. Muizen kregen WGP op dag 0 en werden geïmplanteerd met orthotope KPC pancreastumoren op dag 7. Muizen werden op dag 21 geëuthanaseerd en pancreasweefsels werden gekleurd met Ly6G om de efficiëntie van granulocytendepletie op dat moment te beoordelen.

Monstervoorbereiding van CyTOF-massacytometrie.

Massacytometrie-antilichamen werden ofwel gekocht bij Fluidigm of werden intern gemaakt door in de handel verkrijgbare gezuiverde antilichamen te conjugeren aan de juiste metaalisotoop met behulp van de MaxPar X8 Polymer- of MCP9 Polymer-kits (Fluidigm). Pancreasmonsters van drie PBS- en drie 7-daagse WGP-muizen werden verwerkt tot een eencellige oplossing en ex vivo stimulatie werd uitgevoerd zoals hierboven beschreven. Cellen werden voorzichtig van de platen geschraapt met behulp van een steriele celschraper, gewassen met PBS en in een steriele kweekbuis geplaatst. Er werden ongeveer 2 x 106 cellen per monster gebruikt. Cellen werden eerst gekleurd op levensvatbaarheid met 5 uM cisplatine (Fluidigm) in serumvrij RPMI 1640 gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Cellen werden vervolgens gewassen met RPMI 1640 met 10 procent FBS gedurende 5 minuten bij 300 x g. Cellen werden gedurende 30 minuten bij KT gekleurd met de oppervlakte-antilichamen en tweemaal gewassen met Maxpar Cell-kleuringsbuffer (Fluidigm).

Voor kleuring op intracellulaire cytokinen werden cellen vervolgens gefixeerd met 1 ml 1X Maxpar Fix I-buffer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur en vervolgens tweemaal gewassen met 2 ml 1X Maxpar Perm-S-buffer gedurende 5 minuten bij 800 x g. De cytoplasmatische/uitgescheiden antilichaamcocktail werd vervolgens toegevoegd en gedurende 30 minuten bij KT met de cellen geïncubeerd. Na incubatie werden de cellen gewassen met 1 ml 1X Maxpar Perm-S-buffer gedurende 5 minuten bij 800 x g en voorzichtig geblot om alle vloeistof uit de buis te verwijderen.

Om te kleuren op nucleaire antigenen, werden cellen vervolgens gesuspendeerd in 1 ml 1X Maxpar nucleaire antigeenkleuringsbuffer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. De nucleaire antigeen-antilichaamcocktail werd vervolgens toegevoegd en gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur geïncubeerd. Cellen werden tweemaal gedurende 5 minuten gewassen bij 800 x g met 2 ml Nuclear Antigen Staining Permeability-buffer. Ten slotte werden de cellen gefixeerd met 1,6 procent formaldehyde gedurende 10 minuten bij KT, vervolgens overnacht geïncubeerd in 125 nM IntercalatorIridium (Fluidigm) bij 4 graden.

CyTOF-gegevensverzameling.

Zodra de cellen klaar waren voor acquisitie, werden monsters tweemaal gewassen met Cell Staining Buffer (Fluidigm) en op ijs bewaard in afwachting van acquisitie. Direct voor de acquisitie werden de cellen gesuspendeerd in een 1:9 oplossing van Cell Acquisition Solution: EQ 4 element calibratiekorrels (Fluidigm). Er werd een Helios CyTOF-systeem gebruikt en volgens de juiste opstart- en afstemmingsprocedures werden monsters uitgevoerd met een snelheid van minder dan of gelijk aan 500 gebeurtenissen/seconde tot 300,000 gebeurtenissen. Met behulp van de CyTOF-software werden FCS-bestanden genormaliseerde.FCS-bestanden en deze bestanden waren vervolgens klaar voor gegevensanalyse.

CyTOF-gegevensanalyse.

CyTOF-gegevens werden geanalyseerd met behulp van FlowJo, het CytoBank-softwarepakket58 en de CyTOF-workflow59 die een reeks pakketten bevat die beschikbaar zijn in R (r-project.org)60-63. Voor analyse uitgevoerd binnen de CyTOF-workflow werden FlowJo-werkruimtebestanden geëxporteerd uit Flow Workspace en CytoML gebruikt61.

RNA-sequencing: RNA-extractie en -isolatie.

Zeven dagen na toediening van PBS of WGP IP werden pancreata geoogst, verwerkt tot een enkele celsuspensie, gekleurd op levensvatbaarheid, CD45 en CD11b, en gesorteerd met behulp van een FACS Aria III. Monsters werden in drievoud bereid voor elke experimentele groep. Nadat deze myeloïde cellen waren geïsoleerd, werden de cellen 2x gewassen met ijskoude PBS en vervolgens gelyseerd met Trizol (Invitrogen). RNA's werden geëxtraheerd met behulp van een QIAGEN RNAeasy Kit (QIAGEN).

Het geïsoleerde RNA werd gecontroleerd op integriteit met behulp van het Agilent Bioanalyzer 2100-systeem (Agilent Technologies, Santa Clara, CA) en gekwantificeerd met behulp van een Qubit fluorometrische assay (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA). Poly-A-verrijkte mRNA-Seq-bibliotheken werden bereid volgens het Universal Plus mRNASeq-kit-standaardprotocol (Tecan Genomics, Redwood City, CA) met behulp van 10 ng totaal RNA.

Alle monsters werden geligeerd met Illumina-adapters en individueel voorzien van een streepjescode. De afwezigheid van adapterdimeren en een consistente bibliotheekgrootte van ~ 300 bp werd bevestigd met behulp van de Agilent Bioanalyzer 2100. De bibliotheekconcentratie en het sequentiegedrag werden beoordeeld over een gestandaardiseerde spike-in van PhIX met behulp van een Nano MiSeq-sequencing-stroomcel van Illumina. 1,8 pm van de gepoolde bibliotheken met 1 procent PhiX spike-in werd geladen op één NextSeq 500/550 75 cycli High Output Kit v2 sequencing flow cell en gesequenced op de Illumina NextSeq 500 sequencer gericht op 60 M 1x75 bp reads per sample.

RNA-sequencing.

Bibliotheken werden voorbereid met behulp van de Universal Plus mRNA-seq-kit met NuQuant®-bibliotheekkwantificatie (NuGen). De zes monsters werden in één run over vier sequentiëringslijnen verspreid. De 24 single-end raw sequencing-bestanden (.fastq)64 werden voor analyse gedownload van Illumina's BaseSpace65 naar de KBRIN-server. Kwaliteitscontrole (QC) van de onbewerkte sequentiegegevens werd uitgevoerd met behulp van FastQC (versie 0.10.1)66. De sequenties werden uitgelijnd met het mm10 muisreferentiegenoom met behulp van STAR (versie 2.6)67, waardoor uitlijningsbestanden in bam-indeling werden gegenereerd. Differentiële expressie van ENSEMBL-eiwitcoderende transcripten werd uitgevoerd met behulp van DESeq268,69. Ruwe tellingen werden verkregen uit de STAR-uitgelijnde bam-formaatbestanden met behulp van HTSeq (versie 0.10.0)70. De onbewerkte tellingen werden genormaliseerd met behulp van de Relative Log Expression (RLE) -methode en vervolgens gefilterd om genen met minder dan tien tellingen over de monsters uit te sluiten71. RNA-seq-gegevens werden gedeponeerd met GEO-toegang GSE187464.

RNA-sequencing: verrijkingsanalyse van genensets.

Gene set verrijkingsanalyse (GSEA) werd gebruikt om de biologie van de genen die de WGP versus PBS-condities en hun verschillen omvatten verder te karakteriseren72. Genensets werden verkregen uit de Molecular Signatures Database (MSigDB) voor biologische processen van Gene Ontology (GO) en Reactome-routes. Voor elke genenset werden alle geteste genlocaties in de vergelijking van met WGP versus met PBS behandelde controlemuizen gesorteerd van de hoogste naar de laagste significantie met behulp van p-waarden. Deze benadering maakt het mogelijk om zeer significante omhoog en omlaag gereguleerde genen op te nemen in elke genenset, een benadering die de omstandigheden in een biologische route nauwkeuriger weergeeft. Voor deze analyse wordt een tabel met de verrijkte sets gevolgd door een verrijkingsplot die het profiel van de verrijkingsscore (ES) en de positie van leden van de genenset op de gerangschikte lijst weergeeft.

Single-cell sequencing: isolatie van enkele cellen en RNA-sequencing.

Levende CD45 plus-cellen werden gesorteerd uit muizenpancreata, gewassen en opnieuw gesuspendeerd in 1x PBS (calcium- en magnesiumvrij) met 0,04 procent BSA. Afzonderlijke cellen werden vastgelegd en cDNA-bibliotheken met barcode werden geconstrueerd met behulp van de Chromium Next GEM Single-Cell 3ʹ Reagent Kit (v3.1, 10X Genomics) en de Chromium Controller, volgens de instructies van de fabrikant. Bibliotheken werden samengevoegd en gesequenced met behulp van een configuratie van 28 bp × 8 bp × 125 bp voor read1 × i7 index x read2 op de Illumina NextSeq 500 met de NextSeq 500/550 150 cyclus High Output Kit v2.5 (20024907).

Sinds celsequencing: profilering van genexpressie.

Bcl-bestanden werden gedemultiplext tot fastq-bestanden met behulp van de CellRanger-software (10X Genomics, v3.1.{{10}}). Het totale aantal gesequenced reads was 506.913.062. De uitlezingen waren van goede kwaliteit, zoals bepaald door FastQC66. Het aantal genen werd gemeten met behulp van CellRanger "count", waarbij gebruik werd gemaakt van het celranger-mm10-3.0.0-referentiegenoom voor muizen. Voor elk monster werd een tellingsmatrix gegenereerd en één geaggregeerd monster met het verwachte aantal cellen ingesteld op 5000.

De onbewerkte telgegevens die door CellRanger werden bepaald, werden gebruikt als invoer voor een aangepaste analysepijplijn in R, die gebruikmaakt van verschillende eencellige analysetools op basis van Seurat. De kniegrafiek (aanvullende afbeelding 7b) geeft een grafiek weer die de gerangschikte UMI-tellingen voor elke celstreepjescode toont voor gegevens die over de drie groepen zijn verzameld. Cellen boven het buigpunt vertegenwoordigen mogelijke doubletten, terwijl die onder de knie achtergrondcellen vertegenwoordigen. Maatregelen voor celkwaliteitscontrole werden geanalyseerd met behulp van Seurat v373, en celstreepjescodes met de volgende kenmerken werden uit de analyse verwijderd: lage aantallen (mogelijke achtergrondcellen) met een FDR-grenswaarde van 0.01 van de DropletUtils74-functie "emptyDrops", hoge tellingen (mogelijke doubletcellen) met meer tellingen dan het buigpunt van de knieplot, mitochondriale inhoud groter dan 30 procent en ribosomale inhoud groter dan 40 procent. Genen (kenmerken) werden verder gefilterd om gepensioneerde gen-identificatoren en genen te verwijderen die niet in ten minste twee cellen tot expressie werden gebracht. Zie aanvullende afbeelding 7a, b voor het initiële en gefilterde aantal celstreepjescodes en genen.

De expressiegegevens werden genormaliseerd met behulp van SCTransform75, waarbij celcyclusgenen, ribosomale inhoud en mitochondriale inhoud achteruitgingen. De cellen werden vervolgens geclusterd en dimensiereductie werd uitgevoerd met behulp van UMAP76. Initiële clusternamen werden toegewezen met behulp van een aangepaste GSVA77,78 verrijkingsscoretechniek. Voor elk van deze clusters werden de belangrijkste merkergenen geïdentificeerd. Differentieel tot expressie gebrachte genen die elk cluster met elk ander cluster vergeleken (alle paarsgewijze vergelijkingen) werden bepaald met behulp van Seurat73 en MAST79. scRNA-seq-gegevens werden gedeponeerd bij GEO-toegang GSE187464.

Identificatie van clusters gegenereerd met scRNA-Seq.

Niet van myeloïde afgeleide clusters werden over het algemeen geclassificeerd als B-cellen (MS4A1), plasmacellen (SDC1), CD8 plus T-cellen (CD3e, C8a), CD4 plus T-cellen (CD3e, CD4), T-regulerende cellen (T -regs) (CD3e, CD4, FoxP3), δ T-cellen (CD3e, TRGC1, TRGC2,IL7Ra) en type 2 aangeboren immuuncellen (ILC2s) (Alox5, KLRG1, Ly6a, Pparg,GATA3, IL-5 , IL-13, ICOS en Rxrg)80–82. Neutrofielen werden geïdentificeerd via MMP9-, Csf3r-, S100A8-, S100A8- en ADAM8-expressie, hoewel ze in deze analyses mogelijk ondervertegenwoordigd zijn vanwege hun lage RNA-gehalte en hoge niveaus van intrinsieke RNases83. Conventionele dendritische cellen (cDC's) werden geïdentificeerd via ITGAX- en ITGAE-expressie en plasmacytoïde DC's (pDC's) werden geïdentificeerd door ITGAX en Siglech.

Classificatie van myeloïde clusters van scRNA-Seq.

Cluster 5 bracht ITGAMINtADGRE1HiLyz2HiH2-Ab1HiLy6C2- tot expressie en bracht TNFAIP2 niet tot expressie, wat aangeeft dat deze cellen residente macrofagen zijn. Cluster10 bracht ITGAM-HiADGRE1HiLyz2Hi H2-Ab1Int Ly6C2- tot expressie. Clusters 3 en 4 brachten ITGAMINt ADGRE1Int Lyz2Hi H2-Ab1Int Ly6C2Hi tot expressie, wat suggereert dat beide subsets zijn van infiltrerende monocyten/macrofagen, hoewel de versterkte inflammatoire genen die tot expressie worden gebracht in cluster 3 werden gebruikt om cluster 3 te identificeren als inflammatoire infiltrerende monocyt/macrofaag .

Fagocytose-assays.

De alvleesklier van met PBS/microdeeltjes geïnjecteerde muizen en in vivo WGP-getrainde muizen werden 7 dagen na injectie geoogst en zoals eerder beschreven verwerkt tot een enkele celsuspensie. Ongeveer 2 x 106 werden gewassen met HEPES verdund 50x in RPMI 1640 en vervolgens geïncubeerd in 100 ul van deze oplossing gedurende 1 uur bij 37 graden om de cellen te activeren. De Invitrogen bevordert Green S.

Aureus BioParticlesTM fagocytosekit voor flowcytometrie (Thermo Fisher Scientific) werd gebruikt volgens de instructies van de fabrikant. Ongeveer 100 μl van de gereconstitueerde deeltjes of 1 x 106 GFP plus KPC-tumorcellen werden toegevoegd aan de geactiveerde pancreascellen en gedurende 1 uur bij 37 graden geïncubeerd. Monsters werden elke 15 minuten voorzichtig gevortext. De reactie werd gestopt door 1 ml koude PBS toe te voegen. Monsters werden gedurende 10 minuten bij 4 graden geïncubeerd met Fc Block, gekleurd op levensvatbaarheid, CD45, CD11b en F4/80 gedurende 30 minuten bij 4 graden en vervolgens geanalyseerd met behulp van een BD FACSCanto. Voor analyse werd vastgesteld dat cellen die fluoresceerden in het FITC-kanaal fagocytisch waren, na poortvorming op levende cellen en CD45.

Cytotoxiciteitstest.

De pancreas van met WGP en PBS behandelde muizen werd geoogst en de CD11b plus-populaties werden geïsoleerd met behulp van magnetische CD11b plus MicroBeads (Miltenyi Biotec) en een autoMACS Pro Separator (Miltenyi Biotec). Gezuiverde CD11b plus-cellen werden vervolgens gewassen en geteld, en deze werden uitgeplaat in een verhouding van 1:20 tumor:effectorcellen in een 96-putjesplaat. Alle experimentele monsters werden in drievoud uitgevoerd. Na het uitplaten van de CD11b plus-cellen werden de ROS-remmers N-acetyl-Lcysteïne (NAC) (1 mM, Sigma-Aldrich), Trolox (5 μM, Sigma-Aldrich) of DFO (50 μM, Europese Farmacopee) toegevoegd aan één set PBS- en WGP-afgeleide cellen gedurende 1 uur vóór de toevoeging van 5000 luciferase tot expressie brengende KPC plus alvleeskliertumorcellen aan alle putjes. Na 24 uur co-cultuur werden de platen gecentrifugeerd en werd 20 µl van het supernatant gemengd met 100 µl van het Luciferase Assay Reagent (Promega). Luciferase-activiteit gemeten in het supernatant correleerde met tumorcellen die waren gedood door de effectorcellen en werd gemeten met behulp van een luminometer (Femtomaster FB 12, Zylux Corporation). Het spontane luciferasesignaal van geplateerde tumorcellen werd afgetrokken van de meting van het supernatant. Luciferasewaarden worden weergegeven als Relatieve Lichteenheden (RLU's).

In vivo tumormodellen van alvleesklierkanker.

Een KPC-cellijn op een C57BL/6-achtergrond afgeleid van de LSL-KrasG12D/plus; LSL-Trp53R172H/ plus ; Pdx1-Cre (KPC) muismodel gekocht bij Ximbio. Deze en Pan02-cellen die een genereus geschenk waren van Dr. Yong Lu van de Wake Forest University, werden gebruikt in een orthotopisch model van alvleesklierkanker. Een KPC-lijn getransfecteerd met GFP en luciferase (KPCGFP plus Luc plus) was ook een genereuze bijdrage van Dr. Michael Dwinell van het Medical College of Wisconsin. Deze cellen werden uitsluitend gebruikt in albino C57BL/6-muizen.

Voor tumorimplantatie werden muizen verdoofd met behulp van isofluraan en de buik van de muizen werd geprepareerd met betadine en op een steriele manier gedrapeerd. Een midline laparotomie van 2 cm werd uitgevoerd met behulp van een aseptische techniek met steriele instrumenten. Na laparotomie werden de pancreas en milt naar buiten gebracht. Tumorcellen werden gesuspendeerd in ijskoude PBS en gemengd in een verhouding van 1:1 met basaalmembraanmatrix Matrigel (Corning). 0.1 × 106 tumorcellen in 50 µL van de PBS-matrigel-oplossing werden geïnjecteerd in de staart van de alvleesklier met behulp van een 30-gauge insulinespuit. De vorming van een kleine luchtbel duidde op succesvolle implantatie. Het peritoneum werd gesloten met behulp van gecoat polyglycolzuur gevlochten resorbeerbare 5/0 hechtdraad en de huid werd gesloten met zijde gevlochten niet-resorbeerbare 5/0 hechtdraad. (CP Medisch). Buprenorfine werd toegediend voor pijnbestrijding tot 72 uur na de operatie en muizen werden gevolgd.

In vivo beeldvorming.

Muizen orthotopisch geïmplanteerd met GFP plus Luciferase plus KPC-tumorcellen werden IP geïnjecteerd met 150 mg/kg lichaamsgewicht bij 100 µl XenoLight D-Luciferin-K plus Salt Bioluminescent Substrate (PerkinElmer). Na 10 minuten werden muizen verdoofd met isofluraan en in een Biospace Lab Photon Imager geplaatst, een speciale in vivo optische modaliteit bij weinig licht voor bioluminescente en fluorescerende beeldvorming. Er werden beelden van muizen genomen en gebruikt om de tumorgrootte en groei te meten.

Vermengd tumormodel.

Muizen werden getraind met 1 mg WGP en 7 dagen later werden de CD11b plus CCR2 plus en CD11b plus CCR2-populaties gesorteerd en 1: 1 gemengd met KPC-tumorcellen 1 x 105 tumorcellen. Cellen werden orthotopisch geïmplanteerd in WT-muizen en 3 weken later werden muizen geëuthanaseerd en werd de tumorgrootte bepaald.

Combinatietherapie met anti-PD-L1 mAb.

C57BL/6 muizen werden behandeld met WGP op dag −7 en geïmplanteerd met KPC orthotope pancreastumoren op dag 0. Muizen werden behandeld met 200 µg anti-muis anti-PD-L1 mAb (Bio X Cell) of Rat IgG2b isotype controle (Bio X Cell) op dag 3, 7 en 11. Muizen werden vervolgens gecontroleerd op overleving.

WGP als behandeling.

C57BL/6-muizen werden op dag 0 geïmplanteerd met orthotope pancreastumoren van KPC en op dag 4 en 11 kregen de muizen 1 mg IP WGP of PBS. Muizen werden vervolgens gecontroleerd op overleving.

Statistische analyse.

Alle resultaten werden ten minste drie onafhankelijke keren herhaald om te verifiëren, tenzij anders aangegeven. Representatieve resultaten worden getoond. Resultaten worden weergegeven als gemiddelde ± SEM. Gegevens werden geanalyseerd met behulp van een tweezijdige Student's t-test of Mann-Whitney U-test. Vergelijkingen met meerdere groepen werden uitgevoerd met behulp van een eenrichtings- of tweerichtings-ANOVA, gevolgd door Tukey's meervoudige vergelijkingstests. Correlatieanalyses werden uitgevoerd met behulp van de Pearson-correlatiecoëfficiënt (normale verdeling). Statistische significantie werd vastgesteld op p < 0.05. Alle statistische analyses werden uitgevoerd met behulp van GraphPad Prism Software versie 9 (GraphPad Inc., La Jolla, CA).

Rapportage samenvatting.

Meer informatie over het onderzoeksontwerp is beschikbaar in de Nature Research Reporting Summary die aan dit artikel is gekoppeld.

Beschikbaarheid van data

Brongegevens worden in dit document verstrekt. RNASeq-gegevens zijn beschikbaar onder GEO-toetreding GSE187464 en scRNA-Seq-gegevens zijn beschikbaar onder GEO-toetreding GSE187464 Brongegevens worden in dit document verstrekt.

Ontvangen: 2 april 2021; Geaccepteerd: 17 januari 2022.

Referenties

1. ACS. Feiten en cijfers over kanker 2020.

2. Rahib, L. et al. Projectie van kankerincidentie en sterfgevallen tot 2030: de onverwachte last van schildklier-, lever- en alvleesklierkanker in de Verenigde Staten. kanker res. 74, 2913-2921 (2014).

3. Kommalapati, A., Tella, SH, Goyal, G., Ma, WW & Mahipal, A. Hedendaagse behandeling van gelokaliseerde resectabele alvleesklierkanker. Kankers 10, 24 (2018).

4. Bliss, LA, Witkowski, ER, Yang, CJ & Tseng, JF Resultaten bij de operatieve behandeling van alvleesklierkanker. J. Surg. Oncol. 110, 592-598 (2014).

5. Schizas, D. et al. Immunotherapie voor alvleesklierkanker: een update uit 2020. Kanker behandelt. Rev. 86, 102016 (2020).

6. Henriksen, A., Dyhl-Polk, A., Chen, I. & Nielsen, D. Checkpoint-remmers bij alvleesklierkanker. Kanker behandelt. 78, 17–30 (2019).

7. Madden, K. & Kasler, MK Immuuncontrolepuntremmers bij longkanker en melanoom. Semin. Oncol. verpleegsters. 35, 150932 (2019).

8. Kao, HF & Lou, PJ Immuuncontrolepuntremmers voor plaveiselcelcarcinoom van het hoofd en de nek: huidige landschap en toekomstige richtingen. Hoofd. Hals 41, 4–18 (2019). 9. Leinwand, J. & Miller, G. Regulering en modulatie van antitumorimmuniteit bij alvleesklierkanker. Nat. Immunol. 21, 1152-1159 (2020).

10. Royal, RE et al. Fase 2-studie van Ipilimumab (anti-CTLA-4) als monotherapie voor lokaal gevorderd of gemetastaseerd pancreasadenocarcinoom. J. Immunother. 33, 828-833 (2010).

11. O'Reilly, EM et al. Durvalumab met of zonder tremelimumab voor patiënten met gemetastaseerd pancreas ductaal adenocarcinoom: een fase 2 gerandomiseerde klinische studie. JAMA Oncol. 5, 1431-1438 (2019).

12. Weiss, GJ et al. Fase Ib/II-studie van gemcitabine, nab-paclitaxel en pembrolizumab bij gemetastaseerd pancreasadenocarcinoom. Investeren. Nieuwe medicijnen 36, 96-102 (2018). 13. Whatcott, CJ, Posner, RG, Von Hoff, DD & Han, H. in pancreaskanker en tumormicro-omgeving (eds Grippo, PJ & Munshi, HG) Ch. 8 (Transworld-onderzoeksnetwerk, 2012).

14. Karamitopoulou, E. Tumor-micro-omgeving van alvleesklierkanker: het immuunlandschap wordt gedicteerd door moleculaire en histopathologische kenmerken. br. J. Kreeft 121, 5–14 (2019).

15. Daniel, SK, Sullivan, KM, Labadie, KP & Pillarisetty, VG Hypoxie als een barrière voor immunotherapie bij pancreasadenocarcinoom. Clin. Vert. Med. 8, 10–10 (2019).

16. Wang, W. et al. RIP1-kinase stimuleert door macrofagen gemedieerde adaptieve immuuntolerantie bij pancreaskanker. Kankercel 38, 585-590 (2020).

17. Netea, MG et al. Getrainde immuniteit: een programma van aangeboren immuungeheugen bij gezondheid en ziekte. Wetenschap 352, aaf1098 (2016).

18. Bekkering, S. et al. Metabole inductie van getrainde immuniteit via de mevalonaatroute. Cel 172, 135-146 e139 (2018).

19. van der Heijden, C. et al. Epigenetica en getrainde immuniteit. antioxidant. Redox-signaal. 29, 1023-1040 (2018).

20. Priem, B. et al. Getrainde immuniteitsbevorderende nanobiologische therapie onderdrukt tumorgroei en versterkt checkpoint-inhibitie. Cel 183, 786-801 e719 (2020).

21. Kalafati, L. et al. Aangeboren immuuntraining van granulopoëse bevordert antitumoractiviteit. Cel 183, 771-785 e712 (2020).

22. Mitroulis, I. et al. Modulatie van myelopoëse-voorlopers is een integraal onderdeel van getrainde immuniteit. Cel 172, 147–161.e112 (2018).

23. Bekkering, S., Dominguez-Andres, J., Joosten, LAB, Riksen, NP & Netea, MG Getrainde immuniteit: herprogrammering van aangeboren immuniteit bij gezondheid en ziekte. Annu Rev Immunol. 39, 667-693 (2021).

24. Kierdorf, K., Prinz, M., Geissmann, F. & Gomez Perdiguero, E. Ontwikkeling en functie van weefsel-residente macrofagen bij muizen. Semin. Immunol. 27, 369-378 (2015). 25. Calderon, B. et al. De anatomie van de alvleesklier bepaalt de oorsprong en eigenschappen van residente macrofagen. J. Exp. Med. 212, 1497-1512 (2015).

26. Kim, H. De transcriptiefactor MafB bevordert ontstekingsremmende M2-polarisatie en cholesterolefflux in macrofagen. Wetenschap. Rep. 7, 7591 (2017).

27. Kim, SY et al. Ontstekingsremmende effecten van apocynine, een remmer van NADPH-oxidase, bij luchtwegontsteking. Immunol. Cel biol. 90, 441-448 (2012).

28. Liu, M. et al. Transcriptiefactor c-Maf is een controlepunt dat macrofagen programmeert bij longkanker. J Clin. Investeren. 130, 2081-2096 (2020).

29. Zimmerman, KA et al. Eencellige RNA-sequencing identificeert genexpressiehandtekeningen van kandidaat-nierbewoners van macrofagen bij verschillende soorten. J. Am. Soc. Nefrol. 30, 767-781 (2019).

30. Bakos, E. et al. CCR2 reguleert de immuunrespons door de onderlinge omzetting en functie van effector- en regulerende T-cellen te moduleren. J. Immunol. 198, 4659-4671 (2017).

31. Kurihara, T., Warr, G., Loy, J. & Bravo, R. Defecten in de rekrutering van macrofagen en gastheerverdediging bij muizen zonder de CCR2-chemokinereceptor. J. Exp. Med. 186, 1757-1762 (1997).

32. Kuziel, WA et al. Ernstige vermindering van adhesie van leukocyten en extravasatie van monocyten bij muizen met een tekort aan CC-chemokinereceptor 2. Proc. Natl Acad. Wetenschap. VS 94, 12053-12058 (1997).

33. Kratofil, RM, Kubes, P. & Deniset, JF Monocytenconversie tijdens ontsteking en letsel. Arteriocler. Trom. vasc. Biol. 37, 35-42 (2017).

34. Funamizu, N. et al. Macrofaag-migratie-remmende factor induceert overgang van epitheel naar mesenchymaal, verbetert de agressiviteit van de tumor en voorspelt klinische resultaten bij gereseceerd ductaal adenocarcinoom van de alvleesklier. Int. J. Kanker 132, 785-794 (2013).

35. Denz, A. et al. Remming van MIF leidt tot stopzetting van de celcyclus en apoptose in pancreaskankercellen. J. Surg. Res. 160, 29-34 (2010).

36. Su, LJ et al. Door reactieve zuurstofspecies geïnduceerde lipideperoxidatie bij apoptose, autofagie en ferroptose. Oxide. Med. Cel Longev. 2019, 5080843 (2019).

37. Geller, A., Shrestha, R. & Yan, J. Van gist afgeleid glucaan bij kanker: nieuwe toepassingen van een traditioneel therapeutisch middel. Int. J Mol. Wetenschap. 20, 3618 (2019).

38. Shrivastava, P. & Bhatia, M. Essentiële rol van monocyten en macrofagen bij de progressie van acute pancreatitis. Wereld J. Gastroenterol. 16, 3995-4002 (2010).

39. Wang, J. & Kubes, P. Een reservoir van volwassen holte-macrofagen die snel viscerale organen kunnen binnendringen om weefselherstel te beïnvloeden. Cel 165, 668-678 (2016).

40. Qi, C. et al. Differentiële routes die aangeboren en adaptieve antitumor immuunresponsen reguleren door deeltjesvormige en oplosbare van gist afgeleide glucanen. Bloed 117, 6825-6836 (2011).

41. Goodridge, HS et al. Activering van de aangeboren immuunreceptor Dectin-1 na vorming van een 'fagocytische synaps'. Natuur 472, 471-475 (2011).

42. Masuda, Y. et al. Orale toediening van oplosbare -glucanen geëxtraheerd uit Grifola frondosa induceert een systemische antitumor immuunrespons en vermindert immunosuppressie bij tumordragende muizen. Int. J. Kanker 133, 108-119 (2013).

43. Rijst, PJ et al. Farmacokinetiek van fungale (1-3)-bèta-D-glucanen na intraveneuze toediening bij ratten. Int. Immunopharmacol. 4, 1209-1215 (2004).

44. Huang, Y. et al. S1P-afhankelijke handel tussen organen van aangeboren lymfoïde cellen van groep 2 ondersteunt de afweer van de gastheer. Wetenschap 359, 114-119 (2018).

45. Mathä, L. et al. Migratie van longbewoner groep 2 aangeboren lymfoïde cellen verbindt allergische longontsteking en leverimmuniteit. Voorkant. Immunol. 12, 67950 (2021).

46. ​​Ricardo-Gonzalez, RR et al. Weefselspecifieke routes extruderen geactiveerde ILC2's om type 2-immuniteit te verspreiden. J. Exp. Med. 217, e2019117 (2020).

47. Mattiola, I. & Diefenbach, A. Antitumorimmuniteit mogelijk maken door ILC2 te ontketenen. Cel Res. 30, 461-462 (2020).

48. Qian, BZ & Pollard, JW Macrofaagdiversiteit verbetert tumorprogressie en metastase. Cel 141, 39-51 (2010).

49. Qian, BZ et al. CCL2 rekruteert inflammatoire monocyten om metastase van borsttumoren te vergemakkelijken. Natuur 475, 222-225 (2011).

50. Munn, DH & Cheung, NK Fagocytose van tumorcellen door menselijke monocyten gekweekt in recombinante macrofaag-koloniestimulerende factor. J. Exp. Med. 172, 231-237 (1990).

51. Jadus, MR et al. Macrofagen doden T9-glioomtumorcellen die de membraanisovorm van de macrofaagkoloniestimulerende factor dragen via een fagocytose-afhankelijke route. J. Immunol. 160, 361-368 (1998).

52. Zhou, X., Liu, X. & Huang, L. Macrofaag-gemedieerde tumorcelfagocytose: een kans voor nanomedicine-interventie. Adv. Functie zaak. 31, 2006220 (2021).

53. Lecoultre, M., Dutoit, V. & Walker, PR Fagocytische functie van tumor-geassocieerde macrofagen als een belangrijke bepalende factor voor de controle van tumorprogressie: een overzicht. J. Immunother. Kanker 8, e001408 (2020).

54. Cui, S., Reichner, JS, Mateo, RB & Albina, JE Geactiveerde muriene macrofagen induceren apoptose in tumorcellen via stikstofmonoxide-afhankelijke of -onafhankelijke mechanismen. kanker res. 54, 2462-2467 (1994).

55. Brahmer, JR et al. Veiligheid en activiteit van anti-PD-L1-antilichaam bij patiënten met gevorderde kanker. N. Engels. J Med. 366, 2455-2465 (2012).

56. Saijo, S. et al. Dectin-1 is vereist voor de afweer van de gastheer tegen Pneumocystis carinii, maar niet tegen Candida albicans. Nat. Immunol. 8, 39-46 (2007).

57. Bernhagen, J. et al. Zuivering, bioactiviteit en secundaire structuuranalyse van muis- en menselijke macrofaagmigratie-remmende factor (MIF). Biochemie 33, 14144-14155 (1994).

58. Chen, TJ & Kotecha, N. Cytobank: biedt een analyseplatform voor analyse en samenwerking van gemeenschapscytometriegegevens. Curr. Bovenkant. Microbiol. Immunol. 377, 127-157 (2014).

59. Nowicka, M. et al. CyTOF-workflow: differentiële ontdekking in high-throughput high-dimensionale cytometrie-datasets. F1000Res. 6.748 (2017).

60. Wilkerson, MD & Hayes, DN ConsensusClusterPlus: een tool voor het ontdekken van klassen met betrouwbaarheidsbeoordelingen en het volgen van items. Bio-informatica 26, 1572-1573 (2010). 61. Finak G., JM FlowWorkspace: infrastructuur voor weergave van en interactie met gated en ungated cytometriegegevenssets. Bioconductor-versie (2019).

62. Finak, G., Jiang, W. & Gottardo, R. CytoML voor platformonafhankelijke uitwisseling van cytometriegegevens. Cytom. Deel A: J. Int. Soc. Anaal. Cytol. 93, 1189-1196 (2018).

63. Crowell, HL, Zanotelli, VRT, Chevrier, S. & Robinson, MD CATALYST: tools voor analyse van cytometrische gegevens. R-pakket versie 1.10.3. HelenaLC/CATALYST (2020).

64. Cock, PJ, Fields, CJ, Goto, N., Heuer, ML & Rice, PM Het Sanger FASTQ-bestandsformaat voor sequenties met kwaliteitsscores en de Solexa/Illumina FASTQ-varianten. Nucleïnezuren Res. 38, 1767-1771 (2010).

65. Illuminatie. BaseSpace-gebruikershandleiding. 2014.

66. Andrews, S. FastQC: een kwaliteitscontroletool voor reeksgegevens met een hoge doorvoer.

67. Dobin, A. et al. STAR: ultrasnelle universele RNA-seq-aligner. Bio-informatica 29, 15-21 (2013).

68. Love, MI, Huber, W. & Anders, S. Gemodereerde schatting van vouwverandering en dispersie voor RNA-seq-gegevens met DESeq2. Genoom Biol. 15.550 (2014).

69. Trapnell, C. et al. Differentiële gen- en transcriptie-expressieanalyse van RNAseq-experimenten met TopHat en manchetknopen. Nat. Protocol. 7, 562-578 (2012).

70. Anders, S., Pyl, PT & Huber, W. HTSeq – een Python-framework om te werken met high-throughput sequencing-gegevens. Bio-informatica 31, 166-169 (2015).

71. Boyle, EI et al. GO::TermFinder – open-source software voor toegang tot Gene Ontology-informatie en het vinden van aanzienlijk verrijkte Gene Ontology-termen die zijn gekoppeld aan een lijst met genen. Bio-informatica 20, 3710-3715 (2004).

72. Kanehisa, M. & Goto, S. KEGG: kyoto-encyclopedie van genen en genomen. Nucleïnezuren Res. 28, 27-30 (2000).

73. Stuart, T. et al. Uitgebreide integratie van single-cell data. Cel 177, 1888-1902. e1821 (2019).

74. Lun, AT, Riesenfeld, S., Andrews, T., Gomes, T. & Marioni, JC EmptyDrops: cellen onderscheiden van lege druppeltjes in op druppeltjes gebaseerde eencellige RNA-sequencinggegevens. Genoom Biol. 20, 1–9 (2019).

75. Hafemeister, C. & Satija, R. Normalisatie en variantiestabilisatie van eencellige RNA-seq-gegevens met behulp van geregulariseerde negatieve binominale regressie. Genoom Biol. 20, 1–15 (2019).

76. Becht, E. et al. Dimensionaliteitsreductie voor het visualiseren van eencellige gegevens met behulp van UMAP. Nat. Biotechnologie. 37, 38-44 (2019).

77. Diaz-Mejia, JJ et al. Evaluatie van methoden om celtypelabels toe te wijzen aan celclusters van eencellige RNA-sequencinggegevens. F1000Res. 8 ISCB Comm J-296 (2019). 78. Hänzelmann, S., Castelo, R. & Guinney, J. GSVA: variatieanalyse van genenreeksen voor microarray- en RNA-seq-gegevens. BMC bio-informatie. 14, 7 (2013).

79. Finak, G. et al. MAST: een flexibel statistisch raamwerk voor het beoordelen van transcriptieveranderingen en het karakteriseren van heterogeniteit in eencellige RNA-sequencinggegevens. Genoom Biol. 16, 1–13 (2015).

80. Suffiotti, M., Carmona, SJ, Jandus, C. & Gfeller, D. Identificatie van aangeboren lymfoïde cellen in eencellige RNA-Seq-gegevens. Immunogenetica 69, 439-450 (2017).

81. Entwistle, LJ et al. Longgroep 2 aangeboren lymfoïde celfenotype is contextspecifiek: het bepalen van het effect van spanning, locatie en stimuli. Voorkant. Immunol. 10, 3114 (2020).

82. Ricardo-Gonzalez, RR et al. Weefselsignalen drukken ILC2-identiteit in met een anticiperende functie. Nat. Immunol. 19, 1093-1099 (2018).

83. Zilionis, R. et al. Eencellige transcriptomics van longkanker bij mens en muis onthult geconserveerde myeloïde populaties bij individuen en soorten. Immuniteit 50, 1317–1334.e1310 (2019).

Dankbetuigingen

De auteurs willen Dr. Wolfgang Zacharias, Dr. Mei Zhang en Sabine Waigel van de Brown Cancer Center Genomics Facility bedanken voor hun hulp bij RNA-Seq en scRNASeq. We willen ook Dr. Clint Geller bedanken voor het proeflezen van het manuscript. Dit werk werd ondersteund door NIH R01CA213990 en R01AI128818 (JY). CD en CTW werden gedeeltelijk ondersteund door de NIH P20GM135004. Een deel van dit werk werd uitgevoerd met de hulp van de UofL Genomics Facility, die wordt ondersteund door NIH P20GM103436 (KY IDeA Networks of Biomedical Research Excellence), het Brown Cancer Center en gebruikersvergoedingen. CyTOF werd uitgevoerd in de Functional Immunomics Core ondersteund door NIH P20GM135004 (Jun Yan/Jason Chesney, MPI). Sequencing en bioinformatica-ondersteuning voor dit werk werd geleverd door NIH P20GM103436 (Nigel Cooper, PI) en NIH P20GM106396 (Donald Miller, PI). De inhoud van dit werk valt uitsluitend onder de verantwoordelijkheid van de auteurs en vertegenwoordigt niet de officiële standpunten van de NIH of het National Institute for General Medical Sciences (NIGMS).

Auteur bijdragen

AEG ontwierp en voerde de experimenten uit, analyseerde gegevens, interpreteerde de resultaten en schreef het manuscript. RS, CD en HG hebben bijgedragen aan experimenteel ontwerp, data-acquisitie en data-analyse. MRW, XH en MZ hielpen bij het verzamelen van gegevens en het voorbereiden van materialen. KA en ECR droegen bij aan de computationele analyse en interpretatie van RNA-Seq-analyses en JHC en ECR droegen bij aan de computationele analyse en interpretatie van ScRNA-Seq-analyses. DT en CTW hebben bijgedragen aan de analyse van CyTOF-gegevens. RAM, H.-gZ en YL droegen materiaal bij en begeleidden het project. RAM heeft een kritische beoordeling uitgevoerd. JY leidde het experimentele ontwerp en de algehele studie, interpreteerde gegevens, begeleidde onderzoek en assisteerde bij het schrijven en beoordelen van het manuscript.

Concurrerende belangen

De auteurs verklaren geen tegenstrijdige belangen.

Extra informatie

Aanvullende informatie De online versie bevat aanvullend materiaal dat beschikbaar is op https://doi.org/10.1038/s41467-022-28407-4.

Correspondentie en verzoeken om materialen moeten worden gericht aan Jun Yan.

Informatie over collegiale toetsing

Nature Communications bedankt George Miller en de andere, anonieme reviewer(s) voor hun bijdrage aan de peer review van dit werk. Peer reviewer-rapporten zijn beschikbaar.

Herdrukken en toestemmingsinformatie zijn beschikbaar op http://www.nature.com/reprints

Noot van de uitgever Springer Nature blijft neutraal over jurisdictieclaims in gepubliceerde kaarten en institutionele voorkeuren.

Open toegang Dit artikel is gelicenseerd onder een Creative Commons Attribution 4.0 Internationale licentie, die het gebruik, delen, aanpassen, verspreiden en reproduceren in elk medium of formaat toestaat, zolang je de oorspronkelijke auteur op gepaste wijze vermeldt (s) en de bron, geef een link naar de Creative Commons-licentie en geef aan of er wijzigingen zijn aangebracht.

De afbeeldingen of ander materiaal van derden in dit artikel zijn opgenomen in de Creative Commons-licentie van het artikel, tenzij anders aangegeven in een kredietlijn bij het materiaal. Als materiaal niet is opgenomen in de Creative Commons-licentie van het artikel en het door u beoogde gebruik niet is toegestaan ​​door wettelijke voorschriften of het toegestane gebruik overschrijdt, moet u rechtstreeks toestemming krijgen van de houder van het auteursrecht. Om een ​​kopie van deze licentie te bekijken.

For more information:1950477648nn@gmail.com