De weg naar vooruitgang in preklinisch onderzoek naar leeftijdsgebonden neurodegeneratieve ziekten: een perspectief op knaagdier- en HiPSC-afgeleide modellen, deel 5

Voordelen van van hiPSC afgeleide cellulaire systemen en ziektemodellen

Verbeterde platforms voor ziektemodellering en medicijnontdekking

Het potentieel voor op hiPSC gebaseerde in vitro modellen om zeer informatief te zijn voor NDD's met onderzoek naar menselijke genetische componenten is groot.

De relatie tussen menselijke genetica en geheugen is een veelbesproken onderwerp, vooral in de moderne samenleving, waar we ons richten op persoonlijke ontwikkeling en leren. Hoewel onze genetische informatie onze basiskenmerken bij de geboorte bepaalt, verschilt het geheugen van vaste kenmerken zoals onze lengte en huidskleur. In plaats daarvan kan het worden gecultiveerd en verbeterd, en speelt het een belangrijke rol in het dagelijks leven.

Allereerst blijkt uit wetenschappelijk onderzoek dat geheugen niet direct verband houdt met genetische genen. Hoewel sommige mensen slimmer geboren worden dan anderen, kan het geheugen op de lange termijn geleidelijk worden verbeterd door te leren en te cultiveren. In ons leerproces van de basisschool tot de universiteit moeten we ons geheugen voortdurend gebruiken en verbeteren om onze academische prestaties te verbeteren. We onthouden bijvoorbeeld problemen en oplossingen door herhaalde evaluatie en oefening, wat helpt ons geheugenvermogen te oefenen.

Ten tweede helpt een gezonde levensstijl ons geheugen ook enorm. Lichamelijke gezondheid heeft een grote impact en effect op het geheugen, zoals voldoende slaap, een gezond dieet en matige lichaamsbeweging. We beginnen bij ons eigen lichaam en blijven gezond door beweging en een gezonde levensstijl, waardoor ons geheugen helderder en scherper wordt.

Ten slotte kunnen we ook ons ​​geheugenvermogen vergroten door voortdurend onze horizon te verbreden en aan verschillende nieuwe dingen deel te nemen. We kunnen bijvoorbeeld proberen een nieuwe taal te leren en deel te nemen aan sociale activiteiten zoals reizen, en deze ervaringen kunnen meer herinneringen in onze geest creëren.

Kortom, de relatie tussen de menselijke genetica en het geheugen is complex en divers, en uiteraard zullen er overeenkomstige verschillen zijn op basis van persoonlijke genetische verschillen. Maar we moeten niet negeren wat we kunnen doen: het verbeteren van ons geheugen en ons zelfmanagementvermogen door voortdurend te leren, gezond te leven en voortdurend onze horizon te verbreden, is voor ons de beste manier om genetische verschillen te overwinnen. Het is duidelijk dat we ons geheugen moeten verbeteren, en Cistanche kan het geheugen aanzienlijk verbeteren, omdat Cistanche een traditioneel Chinees medicijn is met veel unieke effecten, waaronder het verbeteren van het geheugen. De werkzaamheid van Cistanche komt voort uit de verschillende actieve ingrediënten, waaronder looizuur, polysachariden, flavonoïde glycosiden, enz. Deze ingrediënten kunnen op veel manieren de gezondheid van de hersenen bevorderen.

Klik op Know om het kortetermijngeheugen te verbeteren

Het vermogen om NDD-kandidaatgenen te correleren met cellulaire fenotypen, zoals RNA- en eiwitexpressieprofielen, morfologische veranderingen en biochemische kenmerken in van hiPSC afgeleide cellen, vergemakkelijkt onderzoeken naar de manier waarop de menselijke genetische componenten van complexe NDD's, zoals AD en PD, tot expressie worden gebracht. een cellulair niveau.

Bovendien maken hiPSC's de integratie mogelijk van de genetische complexiteit van de onderliggende genetische achtergronden van patiënten in het model, wat vaak wordt ontkend (bijvoorbeeld chemische modellen) of te simpel gemaakt (bijvoorbeeld monogenetische variant diermodellen).

Het is algemeen erkend dat het begin, de progressie en de ernst van neurodegeneratie worden bepaald door complexe genetische factoren en het samenspel van verschillende genetische varianten met relatief kleine effecten.

Dit aangeboren genetische landschap, vastgelegd in van patiënten afgeleide hiPSC-modellen, stelt ons in staat genetische determinanten en biologische factoren te onderzoeken, gecombineerd met de mogelijkheid om modulaire, uiterst betrouwbare in vitro NDD-modellen te genereren, om voort te bouwen op ons huidige begrip van de ziektebiologie. HiPSC-technologie vertegenwoordigt momenteel de enige beschikbare menselijke -gebaseerde modellen waarin het volledige genetische landschap van de patiënten wordt vastgelegd.

Ook maakte de mogelijkheid om genoombewerkingstechnologieën, zoals CRISPR-Cas9, met behulp van hiPSC's toe te passen, het genereren van isogene modellen mogelijk voor de evaluatie van precieze genetische varianten. Naast schaalbaarheid zijn hiPSC's zelfhernieuwbaar.

Van hiPSC afgeleide modellen vormen dus een veelbelovend systeem voor preklinische studies. Bovendien maakt de menselijke genetische diversiteit die wordt vastgelegd in de van de patiënt afkomstige hiPSC-capaciteit ze geschikt voor de evaluatie van "gepersonaliseerde geneeskunde" -benaderingen.

Het vermogen om individuele reacties op behandelingen effectief te screenen en non-responders of zwakke responders te identificeren vóór toediening in een klinische setting benadrukt verder de geschiktheid van van hiPSC afgeleide modellen voor preklinische beoordelingen (Figuur 2).

Gezamenlijk is de potentiële informatie die wordt gegenereerd door preklinische studies in hiPSC-modellen robuust, relevant voor menselijke proefpersonen en essentieel om te implementeren in het ontwerp van klinische onderzoeken (bijvoorbeeld stratificatie van de proefpersonen) om de nauwkeurigheid van de resultaten te verbeteren.

De grenzen van diermodellen overwinnen

hiPSC's bieden een manier om veel van de problemen die aanwezig zijn in de huidige diermodellen te overwinnen, zoals eerder besproken. Ten eerste bieden van iPS afgeleide modellen een op mensen gebaseerd platform voor het evalueren van potentiële therapieën in het feitelijke genetische landschap van de menselijke ziekte.

Ten tweede worden door het afleiden van cellen van patiënten veel technische problemen met betrekking tot de beste manier om ziektemutaties bij de mens te modelleren omzeild, omdat het model de unieke genetische achtergrond van de patiënt bevat. Ten derde zijn hiPSC-cellen gemakkelijk toegankelijk voor genetische en farmacologische manipulatie, waardoor structurele en functionele tests met hoge doorvoer mogelijk zijn die het ziektefenotype beoordelen.

Daartoe hebben we onlangs een van hiPSC afgeleid DA-neuronaal model ontwikkeld, verkregen van een PD-patiënt met SNCA-triplicatie, om een ​​alles-in-één LV GT te beoordelen gericht op het verlagen van SNCA-niveaus. Onze LV-interventie heeft met succes de SNCA-niveaus verlaagd en ziektegerelateerde fenotypen gered door het genereren van reactieve oxidatieve soorten (ROS) en het behoud van de cellulaire levensvatbaarheid.140

Ten vierde kan, vergeleken met het standaard knaagdiermodel, het genereren van in vitro op hiPSC gebaseerde modellen worden bereikt in een aanzienlijk kortere tijdlijn, in de orde van 30 dagen, in tegenstelling tot diermodellen die sterk kunnen variëren van maanden tot jaren.

Ten vijfde, en in overeenstemming met het vorige punt, zijn op hiPSC gebaseerde modellen aanzienlijk minder duur en energieverbruiken dan knaagdiermodellen, vooral als we rekening houden met de lopende verplichtingen en infrastructuur voor de dierenhuishouding, regelgeving, evenals training en nalevingsvereisten. Steeds meer economische preklinische ziektemodellering vergroot de toegankelijkheid voor onderzoeksgroepen om vermeende therapieën te beoordelen, de vertaalbaarheid te verbeteren en uiteindelijk de efficiëntie van de DMT-ontwikkeling te verbeteren.202

Alles bij elkaar geven deze voordelen aan hiPSC-afgeleide modellen een duidelijk voordeel in de studie van neurodegeneratie, en dergelijke modellen hebben het potentieel om nieuwe ontdekkingen te genereren die ontoegankelijk waren in eerdere celcultuur- en dierziektemodellen.

De hier besproken onderzoeken demonstreren de noodzaak en waarde van de integratie van 2D- en 3D-hiPSC-gebaseerde modellen in NDD-mechanistische onderzoeken die factoren ophelderen die betrokken zijn bij het veroorzaken van ziekten en pathogene routes, evenals in translationele en medicijnontdekkingsstudies, zoals identificatie en validatie van therapeutische doeleinden. .

Samen vertegenwoordigen de van hiPSC afgeleide NDD-modellen een sprong voorwaarts in medisch onderzoek door verbeterde ziektemodellering die aanzienlijk haalbaar is, met relatief kortere experimenten die kosteneffectief en misschien wel het allerbelangrijkste zijn: accuraat en geschikt voor het modelleren van ziekten bij de mens.

Figuur 2. Schematische weergave van een verbeterde pijplijn voor de ontwikkeling van DMT-geneesmiddelen voor NDD's door verhoogde integratie en/of vervanging van van hiPSC afgeleide modellen. De ontwikkeling van elke mogelijke DMT begint met de ontdekkingsfase, die zowel de identificatie van relevante gendoelen als ziektemechanismen omvat.

Daaropvolgende ziektemodellen worden in de vroege preklinische fase ontwikkeld om de cellulaire ziektepathofysiologie te onderzoeken en de doelwitten van geneesmiddelen te valideren, evenals vroege screening en optimalisatie van vroege CGT-IP's/DMT's. De progressieve ontwikkeling van DMT's, inclusief verdere modelontwikkeling en doelvalidatie, evenals onderzoek naar off-target-effecten, vindt plaats tijdens de midden-preklinische fase.

Naarmate DMT vordert, wordt in de late preklinische fase verdere informatie over de farmacokinetische en farmacodynamische activiteit verkregen. Het toegenomen gebruik van van hiPSC afgeleide modellen in deze fasen vertegenwoordigt om verschillende redenen een aantrekkelijke verbetering van de bestaande pijplijn voor de ontwikkeling van geneesmiddelen; ze zijn namelijk kosteneffectief, veelzijdig en, belangrijker nog, ze overwinnen veel van de aangeboren beperkingen van bestaande diermodellen van NDD's.

In dit stadium kunnen IND-aanvragen worden ingediend voor vermeende DMT's, die momenteel vier cruciale doelstellingen bevatten waaraan moet worden voldaan bij elke opkomende DMT, met name CGT-IP's: (1) doelselectie, (2) ontwikkeling en optimalisatie van leidende verbindingen, (3) initiële en escalerend doseringsregime, en (4) vaststelling van haalbaarheid en ROA.

Elk van deze kan nauwkeurig en op de juiste manier worden aangepakt door de vervanging van op hiPSC gebaseerde modellen in preklinische onderzoeken. DMT's kunnen dan goedkeuring van de FDA krijgen om klinische onderzoeken te starten.

De integratie van op hiPSC gebaseerde modellen in een aanvullende fase 1a kan worden opgenomen, wat een verbeterde screening van kandidaten in de rekruteringsfase en de identificatie van potentiële non-responders of zwakke responders mogelijk maakt op basis van preklinische genetische onderzoeken.

DMT's met aantoonbare veiligheid in fase 1a gaan vervolgens door naar fase 1, 2 en 3 klinische onderzoeken, waarna degenen met een significant positief effect goedkeuring krijgen van de New Drug Application (NDA) en worden vrijgegeven voor consumentengebruik met voortdurende geneesmiddelenbewaking om voorheen niet-geïdentificeerde geneesmiddelen te identificeren. nadelige gevolgen in de loop van de tijd.

Beperkingen van van hiPSC afgeleide in-vitromodellenTijd en reproduceerbaarheid

De kweektechnologieën van hiPSC's zijn de afgelopen tien jaar ontstaan ​​en hun bruikbaarheid voor ziektemodellering en preklinische beoordeling van vermeende DMT's is relatief nieuw.

Zoals bij elke opkomende technologie moeten er verschillende beperkingen in overweging worden genomen bij pogingen om de biologische kenmerken van NDD's accuraat na te bootsen. Eerst en vooral kan het kweken van hiPSC's en het genereren van nauwkeurige en betrouwbare celmodellen duur, arbeidsintensief en tijdrovend zijn. Gemiddeld kost het $10,000 tot USD 25,000 om hiPSC-lijnen te valideren op een geschikte standaard voor medisch onderzoek.203

De processen van herprogrammering, differentiatie en rijping duren langer. Cellulaire herprogrammering van startweefsel in hiPSC's kan minstens 20 tot 30 dagen duren,151 en de daaropvolgende cellulaire differentiatie en rijping variëren afhankelijk van het gewenste cellulaire type en de gebruikte methode; Het genereren van volwassen neuronen, astrocyten en microgliacan vergt bijvoorbeeld respectievelijk 6 tot 15 weken,204 4 tot 9 weken,205,206 of 5 tot 9 weken,164,207.

Als gevolg hiervan geven onderzoekers vaak de voorkeur aan het gebruik van voorlopercellen als stabiele tussenproducten voor experimenten, omdat deze in grote lijnen representatief zijn voor het doelceltype en in een sneller tijdsbestek kunnen worden gegenereerd.204 De tijdsbeperkingen en kosten die nodig zijn voor het opzetten van het hiPSC-modelsysteem kunnen dus vormen een bron van zorg voor veel onderzoeksgroepen.

Bovendien is de tijd die nodig is voor de ontwikkeling van belangrijke ziekte-geassocieerde cellulaire fenotypen in van hiPSC afgeleide cellen ook een overweging bij het modelleren van NDD's. Terwijl het decennia van het leven van een patiënt duurt voordat klinische en pathologische symptomen optreden, werden ziektegerelateerde moleculaire fenotypes in van hiPSC afgeleide modellen ongeveer twee maanden na de rijping gedetecteerd.208

Desalniettemin vloeien de beperkingen voort uit de beperkte levensduur van op hiPSC gebaseerde modellen in de cultuur, die mogelijk niet voldoende is om een ​​compleet beeld te ontwikkelen dat lijkt op de ziekte op cellulair en weefselniveau.

Strategieën gericht op het versnellen van het differentiatie- en rijpingsproces, zoals de integratie van Notch- en g-secretaseremmers om de rijpingstijd te verkorten,209 en overexpressie van neurogenine-2 (Ngn2) of NeuroD1158, zijn gedeeltelijk succesvol geweest en introduceerden andere zorgen die voortkwamen uit ectopische expressie.

Andere beperkingen houden verband met de reproduceerbaarheid van de systemen in repetitieve experimenten en de inherente variabiliteit van model tot model, inclusief tegenslagen met betrekking tot de zuiverheid van de van hiPSC afgeleide culturen en de aanwezigheid van ongewenste heterogene cellulaire populaties.210

Het is dus belangrijk om rekening te houden met de heterogeniteit in celpopulaties bij het gebruik van hiPSC-afgeleide ziektemodellen, met name bij DMT-screening en beoordeling van de werkzaamheid. Bovendien is gemeld dat hiPSC-culturen genomische instabiliteit vertonen en vatbaar zijn voor genetische afwijkingen en mutaties tijdens cellulaire expansie en herprogrammering.211

Er moet ook voorzichtigheid worden betracht bij het gebruik van isogene lijnen die zijn gegenereerd door verschillende technieken voor het bewerken van het genoom, omdat potentiële off-target effecten kunnen optreden (bijvoorbeeld onbedoelde klonale variabiliteit tussen isogene lijnen en off-target mutagenese).212,213 Daarom is het belangrijk om periodiek te evalueren de genomische stabiliteit van hiPSC's om een ​​rigoureuze DMT-screening te garanderen.

Uitdagingen bij het samenvatten van sporadische NDD-pathofysiologie en cellulaire fenotypes

De complexiteit van NDD's en het gebrek aan alomvattende karakterisering en mechanistisch begrip van hun cellulaire fenotypes vormen uitdagingen in het vermogen om ze te recapituleren met cellulaire modellen, waaronder op hiPSC gebaseerde systemen.

De oorzaken van NDD's zijn complex en multifactorieel, waaronder polygene risicofactoren (dat wil zeggen meerdere genen en varianten), epigenetische kenmerken, veroudering, geslacht en omgevingsfactoren, zoals triggers van oxidatieve stress, waarvan sommige moeilijk te induceren zijn, met name in een eindeloze lijst van verschillende soorten ziekten. combinaties, in een laboratoriumsysteem.

Bovendien is het merendeel van de uit hiPSC afkomstige AD-PD-modellen afkomstig van patiënten met familiale mutaties die slechts een zeer klein deel van de totale gevallen vertegenwoordigen.214,215 Omdat de mechanismen die ten grondslag liggen aan de familiale versus sporadische vormen verschillend kunnen zijn, is het nodig om modellen op te stellen die zijn afgeleid van hipscs en fibroblasten verkregen van sAD- of sporadische PD-patiënten.

Om dit doel te bereiken zijn er de afgelopen jaren initiatieven ontstaan ​​op het gebied van de celopslagplaatsen van patiënten; deze omvatten Applied StemCell (ASC), California Institute for Regenerative Medicine (CiRA), Cedars Sinai Induced Pluripotent Stem Cell Core, European Bank for Induced Pluripotent StemCells (EBiSC), Korean National Stem Cell Bank (KSCB), NationalInstitute of Aging (NIA) , Nationaal Instituut voor Neurologische Aandoeningen en Stroke (NINDS), Nationaal Instituut voor Algemene Medische Wetenschappen (NIGMS) en het WiCell Research Institute (WiCell) (Tabel S2).

De verwachte groei van deze collecties zal de oprichting van van hiPSC afgeleide modellen vergemakkelijken die geschikter zijn voor onderzoek naar de algemene en sporadische PD.

Niettemin produceren hiPSC-modellen afgeleid van sporadische NDD-patiënten geschikte cellulaire fenotypes die kenmerkend zijn voor AD181 en PD216 na omgevingsmanipulaties, zoals blootstelling aan neurotoxinen en chemische inductie van oxidatieve stress.

Ook onthulde een recente studie veranderingen in de mitochondriale eiwitexpressie en verhoogde oxidatieve stress bij hiPSC's gegenereerd door sAD-patiënten, ondanks een duidelijk gebrek aan Ab- en tau-pathologie,217 wat suggereert dat hiPSC-modellen waardevol inzicht kunnen verschaffen in de genuanceerde pathofysiologie die specifiek is voor sporadische NDD-subtypes.

Bovendien maakte een recent onderzoek van Meyer et al.218 gebruik van hiPSC's afgeleid van sAD-patiënten en ontdekte dat MAPT, dat codeert voor het tau-eiwit, significant verhoogd was in van sAD afkomstige cellen vergeleken met gezonde controles.

Ondanks deze uitdagingen zijn de huidige, van hiPSC afgeleide modellen dus uitstekende surrogaten die de mogelijkheid bieden om ziektepathofysiologie na te bootsen en gouden standaard ziektekenmerken vast te stellen met de volledige genetische onderbouwing bij sporadische patiënten, die kunnen worden ingezet als uitkomstmaten om daaropvolgende ziektemodellen te verbeteren.

For more information:1950477648nn@gmail.com