De relatie tussen cyclo-oxygenase (COX-2) en door hypoxie geïnduceerde ziekte

voor meer informatie:ali.ma@wecistanche.com

Intracellulair prostaglandine E2 draagt ​​bij aan door hypoxie geïnduceerde proximale tubulaire celdood

Coral Garcia-Pastorl, Selma Benito-Martinez, Ricardo J.Bosch1, Ana B. Fernandez-Martinez, Francisco J. Lucio-Cazana

Proximale tubulaire cellen (PTC) zijn bijzonder kwetsbaar voor door hypoxie geïnduceerde apoptose, een relevante factor voornierziekte. We veronderstelden hier dat PTC-sterfte onder hypoxie wordt gemedieerd door cyclo-oxygenase (COX-2)-afhankelijke productie van prostaglandine E,(PGE,), wat werd bevestigd in menselijke proximale tubulaire HK-2-cellen omdat hypoxie (1 procent O,)-geïnduceerde apoptose (i) werd voorkomen door een COX-2(cyclo-oxygenase) remmer en door antagonisten van prostaglandine (EP) receptoren en (ii) werd geassocieerd met een toename van intracellulair PGE,(iPGE,) als gevolg van hypoxie-induceerbare factor-1 -afhankelijke transcriptionele opregulatie van COX{{3 }}(cyclo-oxygenase). Apoptose werd ook voorkomen door remmers van de prostaglandine-opnametransporteur PGT, wat aangaf dat iPGE bijdraagt ​​aan door hypoxie geïnduceerde apoptose (integendeel, door hypoxie/reoxygenatie geïnduceerde PTC-dood was uitsluitend te wijten aan extracellulair PGE). iPGE is dus een nieuwe speler in de pathogenese van door hypoxie geïnduceerd tubulair letsel en PGT zou een nieuw therapeutisch doelwit kunnen zijn voor de preventie van hypoxie-afhankelijke laesies bij nierziekten.

Het is algemeen bekend dat tubulaire hypoxie een relevante factor is voor zowel acute als chronischenierziekte'2 Proximale tubulaire cellen (PTC) zijn zeer actief in termen van zuurstofverbruik vanwege hun energieverslindende activiteiten van reabsorptie en bijgevolg zijn ze kwetsbaar voor hypoxie. Er is aangetoond dat apoptose een relevante rol speelt in gekweekte PTC die wordt blootgesteld aan hypoxie, maar de signaalroutes die verantwoordelijk zijn voor de activering van de apoptotische machinerie zijn niet onderzocht. Wij en anderen hebben ontdekt dat prostaglandine E, (PGE,), een belangrijke lipidemediator van talrijke fysiologische en pathologische processen in denier, speelt een relevante rol bij de signalering die leidt tot PTC-apoptose na behandeling met cisplatine7, albumine8 of leptine en gentamycine. In alle gevallen bleek de toename van PGE afhankelijk te zijn van verhoogde expressie van cyclo-oxygenase-2(COX-2)(cyclo-oxygenase), een induceerbaar enzym dat, samen met COX-1l, de snelheidsbeperkende stap is in de synthese van prostaglandinen. in de mensnier, basaal COX-2(cyclo-oxygenase)expressie is minder intens dan die van COX-1. COX-2(cyclo-oxygenase)is geïdentificeerd in podocyten en delen van de lus van Henle en niervaatstelsel onder fysiologische omstandigheden10. In pathologische toestanden kan COX-2-immunoreactiviteit echter worden gevonden in veel meer celtypen binnen denierinclusief PTC, en draagt ​​mogelijk bij aan nierbeschadiging. Interessant is dat hypoxie de expressie van COX verhoogt-2(cyclo-oxygenase)en/of de productie van PGE,12-i7 in veel celtypen. In feite hebben we eerder ontdekt dat hypoxie de intracellulaire inhoud in PGE verhoogt, evenals de afgifte ervan aan het extracellulaire medium . Daarom is het theoretisch mogelijk dat PGE het apoptotische effect van hypoxie op PTC medieert.

De meeste onderzoeken naar PGE-afhankelijke apoptose waren hoofdzakelijk gericht op mechanismen waarbij extracellulair PGE betrokken is, omdat algemeen wordt aangenomen dat PGE zijn biologische effecten uitoefent door activering van plasmamembraan-omspannende G-eiwit-gekoppelde PGE-receptoren (E-serie prostaglandinereceptoren EP1-4)1. Niettemin is in sommige modellen intracellulair PGE,(iPGE,) relevant bij apoptotische celdood720-22. Dit houdt in dat om apoptose te induceren, PGE het intracellulaire medium opnieuw moet bereiken en een subset van EP-receptoren moet activeren, die zich in de cel bevinden (iEP-receptoren). Omdat de taak van het vastleggen van PGE voornamelijk wordt gedaan door de prostaglandine-opnametransporter (PGT)23-26, resulteert PGT-remming in het voorkomen van door iPGE, gemedieerde apoptotische celdood7.

Rekening houdend met deze achtergrond hebben we in dit werk onderzocht of een COX-2(cyclo-oxygenase)-afhankelijke toename van iPGE, niveaus medieert door hypoxie geïnduceerde apoptose bij PTC.

Klik naar biologische Cistanche voor nierziekte

Methoden:

reagentia.

AG1478, Broomcresolgroen (BG), PGE, AH6809, GW627368X, kristalviolet, trypaanblauwe oplossingen, Broomsulfoftaleïne (BRS), 3-(5'-Hydroxymethyl2'-furyl)-1-benzylindazool (YC1), en actinomycine D werden gekocht bij Sigma (St. Louis, MO, VS). Z-VAD-FMK en celecoxib waren respectievelijk van Calbiochem (Darmstadt, Duitsland) en Cayman Chemical (Ann Arbor, MI, VS). TriReagent werd gekocht bij Vitro (Madrid, Spanje) en PVDF-membranen en Western blotting luminol-reagens werden verkregen bij Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA. VS). ProLong Gold-antifade-reagens met 4,6-diamidino{{14 }} fenylindool (DAPI), annexine-V-FITC (fluoresceïne-isothiocyanaat)/propidiumjodide (PI) apoptose-detectiekit en 2',7'-dichloorfluoresceïnediacetaat (DCFH-DA)-sonde werden gekocht bij Invitrogen (Carlsbad, CA, VS), en Molecular Probes (Oregon, VS), respectievelijk. Antilichamen werden verkregen uit de volgende bronnen: anti-PGE en anti-COX-2(cyclo-oxygenase)antilichamen waren van Abcam (Cambridge, VK); anti-Bax en anti-Bcl-2 waren van Santa Cruz Technologies (Santa Cruz, CA.USA); anti-HIF-la-antilichaam en -rabbit-Alexa-Fluor 488 waren van respectievelijk BD Biosciences (Palo Alto, CA, VS) en Invitrogen (Carlsbad, CA, VS); anti- -actine en konijn-anti-muis IgG-peroxidaseconjugaat werd gekocht bij Sigma (St.Louis, MO, VS).

Celcultuur en experimentele omstandigheden.

Menselijke proximale tubulaire HK-2-cellen werden gekocht bij de American Type Culture Collection (ATCC) (Rockville, MD, VS). serum (FBS), 1 procent penicilline/streptomycine/amfotericine B en 1 procent glutamine (Invitrogen. Carlsbad, CA, VS) en 1 procent insuline-transferrine-selenium (ThermoFisher. Grand Island, NY, VS). In alle experimenten, cellen werden uitgeplaat bij 70-90 procent samenvloeiing, en wanneer ze volledig gehecht waren, werden ze gekweekt onder hypoxische (1 procent zuurstof) of normoxische omstandigheden (21 procent zuurstof).Hypoxieexperimenten werden uitgevoerd in een In vivo200hypoxiewerkstation (Ruskin Technology, West Yorkshire, Verenigd Koninkrijk). Voorhypoxie/reoxygenatie-experimenten, cellen werden onderworpen aan:hypoxiegedurende 24 uur, en daarna werden de cellen tot 3 uur onder normoxische omstandigheden geïncubeerd (reoxygenatieperiode).

Immunofluorescentie-analyse van iPGE en Western-blot-analyse van COX-2(cyclo-oxygenase)en HIF-1 .

Cellen voor immunofluorescentie-analyse en Western-blot-analyse werden respectievelijk verdeeld over glazen dekglaasjes (4 x 104 cellen/glazen dekglaasje) of in platen met zes putjes (15 x 104 cellen/putje) en geïncubeerd zoals beschreven in "Resultaten". Vervolgens werden immunofluorescentie- en immunoblotting-analyse uitgevoerd in wezen zoals eerder beschreven. Antilichaam-werkverdunningen waren: 1/50 voor PGE, 1/1000 voor COX-2(cyclo-oxygenase)/HIF-1a/a-rabbit-Alexa-Fluor 568 en 1/5000 voor -actine. Immunofluorescentiedetectie werd uitgevoerd met behulp van een Leica SP5 confocale microscoop (Leica Microsystems, Wetzlar, Duitsland), via de Confocal Microscopy Service (ICTS 'NANBIOSIS'U17) van het Biomedical Research Networking Center on Bioengineering, Biomaterials, and Nanomedicine (CIBER-BBN bij de Universiteit van Alcal, Madrid, Spanje)

Voorbijgaande transfectie.

Transiënte transfectie met siRNA PGT (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA), de zoogdierexpressievector pcDNA3 die het cDNA bevat van het wildtype menselijke 15-hydroxy-prostaglandinedehydrogenase (p15-PGDH) of de luciferase-reporterplasmideconstructies voor menselijke COX-2(cyclo-oxygenase)phPES2-Luc, menshypoxieresponselement (HRE)p9HIF1-Luc en R. reniformis pRL-CMV (Promega, Madison, WI) en bepaling van luciferase-activiteit werden uitgevoerd zoals elders beschreven27,28.

Celtelling en cel-/kernmorfologie.

Het aantal hechtende cellen werd spectrofotometrisch bepaald met een gemodificeerde kristalviolette kleurmethode2. Om bewijs van apoptose te detecteren, werd celmorfologie waargenomen met behulp van fasecontrastmicroscopie. Celkernen werden zichtbaar gemaakt na DNA-kleuring met DAPI zoals eerder beschreven0. Typische apoptotische morfologie die werd onderzocht, omvatte cellulaire krimp, nucleaire condensatie en fragmentatie en vorming van apoptotische lichamen. Voor kwantificering werden zes velden in elke experimentele conditie op een blinde manier onderzocht om het percentage kernen met apoptose-achtig uiterlijk te schatten.

Flowcytometrie apoptose-assay en cellevensvatbaarheidstest door trypan blauwe kleurstofuitsluitingstest.

Hechtende cellen aan de plaat werden losgemaakt door trypsinisatie en werden samen met de losgemaakte cellen die eerder uit het kweekmedium waren teruggewonnen, voor de test gebruikt.

Annexine-V-FITC/PI-apoptosedetectiekit maakte flowcytometriedetectie van apoptotische en necrotische HK-2-cellen mogelijk, zoals eerder beschreven 7. Vroege en late apoptotische cellen waren respectievelijk positief voor annexine V-kleuring en beide en annexine V vlekken. Necrotische cellen waren alleen positief voor PI en levende HK-2-cellen vertoonden geen kleuring.

Trypan blauwe kleurstofuitsluitingstest werd gebruikt om de levensvatbaarheid van de cellen te beoordelen. Levensvatbare cellen (wit) en dode cellen (blauw) werden geteld met behulp van een lichtmicroscoop en een hemocytometer.

Statistische analyse.

Elk experiment werd minstens drie keer herhaald. De resultaten worden uitgedrukt als het gemiddelde ± SEM. Ze werden onderworpen aan een eenrichtingsvariantieanalyse (ANOVA) gevolgd door Bonferroni's test voor meerdere vergelijkingen. Het significantieniveau werd ingesteld op P Kleiner dan of gelijk aan 0.05.

Resultaten

Hypoxie induceert proximale tubulaire HK-2-celdood.

Hypoxieverminderde het aantal HK-2-cellen, zoals vastgesteld met kristalviolet-assay (Fig. la), en induceerde ook celronding en loslating van de plaat (Fig. lb, bovenste paneel). Zoals verwacht,hypoxieleidde tot een model van celdood met duidelijke morfologische kenmerken van apoptose (zie nucleaire kleuring met DAPI in Fig. lb, onderste paneel, links) zoals celkrimp met significante nucleaire condensatie, fragmentatie en vorming van apoptotisch-achtige lichamen.Hypoxie-geïnduceerde apoptose werd verder bevestigd door de toename van annexine V-FITC-kleuring, zoals beoordeeld door flowcytometrie, en de preventie ervan met pan-caspaseremmer Z-VAD-FMK (Fig. lc).Hypoxiebepaalde ook een afname van het aantal levensvatbare cellen, maar induceerde geen statistisch significante veranderingen in het aantal necrotische cellen (Fig. lc, inzet).

Figuur 1. Hypoxie induceert proximale tubulaire HK-2 celdood.(a) Verminderd aantal cellen (kristalviolettest). (b) Morfologische kenmerken van apoptose. Representatieve fasecontrast-microfoto's (bovenste paneel, originele vergroting, 10 ×) DAPI-kleuring-microfoto's (onderste paneel, originele vergroting, 40 ×). (c) Toename van apoptose (flowcytometriestudies). Annexine V plus-cellen omvatten Annexine V plus /propidiumjodide-cellen (dwz vroege apoptotische cellen met bewaarde plasmamembraanintegriteit) en annexine V plus /propidiumjodide plus-cellen (dwz late apoptotische cellen). Inzet: Typen celpopulaties (Annexine V-/propidiumjodide plus cellen zijn necrotische cellen en annexine V-/propidiumjodide-cellen zijn levende cellen). Resultaten worden uitgedrukt als percentages met betrekking tot het totale aantal gebeurtenissen. Algemene informatie: (1) Cellen werden 24 uur geïncubeerd in normoxische (21% O2) of hypoxische （1 procent O,）-omstandigheden, zoals aangegeven in "Methoden?. pan-caspaseremmer Z-VAD-FMK （25 μM） was toegevoegd 1 uur voor aanvang van blootstelling aanhypoxie. (2) Microfoto's zijn representatieve voorbeelden van drie onafhankelijke experimenten. Staven en foutbalken in grafieken: elke balk vertegenwoordigt het gemiddelde ± SEM van 3 verschillende experimenten *P<0.01 vs.=""><0.01 vs="">hypoxie;**P<0.01 vs.="" normoxia="" and="">hypoxieplus ZVAD.

COX-2(cyclo-oxygenase)/iPGE,/EP-receptorroute bemiddelt proximale tubulaire HK-2-celdood veroorzaakt door hypoxie.

Om de rol van de COX te beoordelen-2(cyclo-oxygenase)/iPGE2/EP-receptorroute inhypoxie-geïnduceerde HK-2 celdood, we pre-incuberen cellen eerst met celecoxib, een COX-2(cyclo-oxygenase)remmer1; AH6809, een antagonist van EP1-, EP2- en EP3-receptoren of GW627368X, een antagonist van EP4-receptor33; of met broomcresolgroen of broomsulfophthale in beide remmers van PGT435.PGT werd ook uitgeschakeld door transfectie met siRNA.

Afbeelding 2. COX-2(cyclo-oxygenase)/iPGE,/EP-receptorroute medieert door hypoxie geïnduceerde proximale tubulaire HK-2-celdood.(a) Preventie van celdood door remmers van de route. Bovenpaneel; De balken tonen het percentage totale celdood (links) of het percentage apoptotische annexine V plus cellen (rechts). Voordat u wordt blootgesteld aan:hypoxie, cellen werden gedurende 1 uur voorgeïncubeerd met 3 M celecoxib（COX-2(cyclo-oxygenase)remmer）;10 uM AH6809, （EP1-3-receptorantagonist）, 10 μM GW627368X（EP4-receptorantagonist）; of met 50 M broomcresolgroen （BG） of 25 μM broomsulfoftaleïne (BrS), twee PGT-remmers. Onderste paneel: Links: Preventie van celdood door PGT neer te halen door transfectie met siRNA (trypan blauwe duikuitsluitingstest). Inzet: Effectiviteit van de knockdown van PGT (Western blot-analyse) Rechts: Concentratieafhankelijkheid van het preventieve effect van broomcresolgroen (BG). (b) Preventie van celdood door transfectie met een zoogdierexpressievector die het prostaglandine-inactiverende enzym 15-hydroxy-prostaglandinedehydrogenase(15-PGDH) cDNA (trypan blauwe kleurstofuitsluitingstest) bevat. Inzet: Expressie van {{ 11}}PGDH (Western-blot-analyse) in getransfecteerde cellen. (c)Hypoxieinduceert een PGT-gevoelige toename in iPGE, Links: PGE,-afhankelijke immunofluorescentie alleen of samengevoegd met nucleaire kleuring met DAPI wordt getoond (originele vergroting, 40 ×) Rechts: Kwantitatieve benadering van de afbeeldingen die in het linkerdeelvenster worden gepresenteerd met behulp van Image J-software. (d) Remmer van EGFR-activering AG1478 voorkomt HK-2 celdood EGFR niet. Cellen werden 1 uur voorgeïncubeerd met l μM AG1478 voordat ze werden onderworpen aanhypoxie. De PGT-remmer BG wijzigt de expressie van Bax en Bcl-2 in HK-2-cellen onderhypoxie(Western-blot-analyse). (f) Preventie vanhypoxie/reoxygenatie-geïnduceerde celdood door remmers van de route (trypaanblauwe kleurstofuitsluitingstest). Cellen werden vooraf geïncubeerd met remmers van de route en onderworpen aanhypoxiezoals bij (a). Vervolgens werden cellen gedurende 3 uur blootgesteld aan normoxia. Algemene informatie: (1) Cellen werden 24 uur geïncubeerd in normoxische (21 procent O,) of hypoxische (1 procent O,) omstandigheden, zoals aangegeven in "Methoden". (2) Microfoto's zijn representatieve voorbeelden van drie onafhankelijke experimenten. (3) Oplosmiddelen van de remmers (luL/mL medium) veranderden het effect vanhypoxieop celdood (resultaten worden niet getoond). (4) Western-blot-analyse: gelijk eiwit werd bevestigd door sonderen met een anti-- -actine- of een anti-GAPDH-antilichaam. (5) Staven en foutbalk in grafieken: elke balk vertegenwoordigt het gemiddelde ± SEM van 3 verschillende experimenten. * P<0.01><0.01>hypoxieofhypoxie/reoxygenatie.

Zoals getoond in Fig. 2a,hypoxie-geïnduceerde proximale tubulaire celdood werd in alle gevallen voorkomen. Remming van apoptose door celecoxib gaf aan dat COX-2(cyclo-oxygenase)speelt een relevante rol inhypoxie-geïnduceerde apoptotische celdood (Fig. 2a, bovenste paneel, rechts). Meer specifiek getuigt het feit dat apoptose werd voorkomen door antagonisme van EP-receptoren dat apoptose wordt gemedieerd door COX-2(cyclo-oxygenase)-afhankelijke productie van PGE. Aan de andere kant is het zeer waarschijnlijk dat iPGE bijdraagt ​​aanhypoxie-geïnduceerde HK-2 celdood omdat het werd voorkomen door; (i) remming van PGT (Fig. 2a) of (i) overexpressie van 15- PGDH (Fig. 2b), die iPGE2 inactiveert via zijn oxidatie25 (merk op, de transfectieprocedure zelf verhoogde de gevoeligheid van HK-2-cellen voorhypoxie: celdood was 45-55 procent voor transfectie in controleomstandigheden vergeleken met 15-20 procent in niet-getransfecteerde cellen). Verdere ondersteuning van de bijdrage van iPGE, aanhypoxie-geïnduceerde HK-2 celdood, zijn onze eerdere bevindingen dat:hypoxiebepaalt een toename van het celgehalte van iPGE,1 en dat deze toename werd voorkomen door PGT-remmers (figuur 2c).

MAPK-signaleringsroutes kunnen apoptose induceren. Omdat iEP-receptoren de epidermale groeifactorreceptor (EGFR)36 transactiveren, wat leidt tot activering van de MAP-kinasen ERK1/2 en p38 in HK-2-cellen0, vroegen we of -incubatie van HK-2-cellen met de remmer van EGFR-activering AG1478 voorkomenhypoxie-geïnduceerde celdood. We vonden negatieve resultaten (Fig. 2d) en daarom is het onwaarschijnlijk dat transactivering van EGFR HK-2-celdood bemiddelt onderhypoxie.

In verschillende experimentele modellen is de reductie van mitochondriaal afgeleid ATP tijdenshypoxieveroorzaakt een toename van de expressieverhouding van het pro-apoptotische eiwit Bax tot anti-apoptotisch eiwit Bcl-2, wat leidt tot afgifte van cytochroom C in het cytosol, activering van caspase 9, en daaropvolgende splitsing en activering van stroomafwaartse effector caspases37,38. Pre-incubatie met PGT-remmer BG in HK-2 cellen onderhypoxieresulteerde niet in veranderingen die compatibel zijn met een anti-apoptotische verschuiving in de balans tussen de expressie van Bc-2 en Bax (Fig.2e), wat de rol van deze eiwitten in de HK-2-cel niet ondersteunt dood onderhypoxie.

Na blootstelling aan hypoxie kunnen episodes van reoxygenatie (ischemie/reperfusieschade) extra celbeschadiging veroorzaken. De "paradox" van reoxygenatiebeschadiging kan worden begrepen, rekening houdend met het feit dat cellen specifieke veranderingen ondergaan in enzymactiviteiten, mitochondriale functie, cytoskeletstructuur, membraantransport en antioxidantafweer als reactie ophypoxie, die dan collectief vatbaar zijn voor reoxygenatieletsel39. Reoxygenatie draagt ​​bij aan acuut nierletsel tijdens ischemische beroerte, niertransplantatie, circulatiefalen of nier- en cardiovasculaire chirurgie. In deze context is de potentiële therapeutische waarde van de remming vanhypoxie/reoxygenatie-geïnduceerde proximale tubulaire celdood door interventie in COX-2(cyclo-oxygenase)/iPGE,/iEP-receptorroute is duidelijk. Daarom vroegen we of iPGE specifiek bemiddelthypoxie-geïnduceerde celdood of ook bemiddelthypoxie/reoxygenatie-geïnduceerde celdood (een in vitro model dat in vivo nierischemie/reperfusieschade nabootst). Zoals getoond in Fig.2f, werd celdood (zoals beoordeeld door de trypan blauwe duikuitsluitingstest) voorkomen door COX-2(cyclo-oxygenase)remmer celecoxib evenals door EP-receptorantagonisten AH6809 of GW627368X. Hetzelfde als voor Fig.2a, deze resultaten suggereren dat COX-2 een relevante rol speelt inhypoxie/reoxygenatie-geïnduceerde celdood en, meer specifiek, dat celdood wordt gemedieerd door COX-2(cyclo-oxygenase)-afhankelijke productie van PGE, omdat het werd voorkomen door antagonisme van EP-receptoren. Omdat celdood echter niet werd voorkomen door PGT-remmers broomcresolgroen of broomsulfoftaleïne (Fig. 2f en Aanvullende Figuur 2d), is het waarschijnlijker dathypoxie/reoxygenatie-geïnduceerde HK-2 celdood wordt uitsluitend gemedieerd door extracellulair PGE.

HIF-1 -afhankelijke transcriptionele regulatie van COX-2(cyclo-oxygenase)genexpressie draagt ​​bij aan ahypoxie-geïnduceerde toename van iPGE, in proximale tubulaire HK-2-cellen. PGE, biosynthese omvat de afgifte van membraanglycerofosfolipiden van arachidonzuur door fosfolipase A, gevolgd door de omzetting door COX-iso-enzymen van arachidonzuur in prostaglandine H, en ten slotte door de isomerisatie van de prostaklier in H, tot PGE, door prostaglandine E-synthasen zoals microsomale PGE-synthase-1 (mPGES-1)19. We hebben gevonden dathypoxie-geïnduceerde apoptose in HK-2-cellen wordt hoogstwaarschijnlijk gemedieerd door een COX-2(cyclo-oxygenase)-afhankelijke toename van de productie van PGE, (Fig. 2). Aangezien COX-2(cyclo-oxygenase)is een enzym waarvan de expressie kan worden geïnduceerd doorhypoxie, veronderstelden we dat ahypoxie-geïnduceerde toename van PGE, productie in HK-2-cellen kan het gevolg zijn van een toename in de expressie van COX-2(cyclo-oxygenase). Om onze hypothese te bevestigen, hebben we (i)het effect vanhypoxieop de uitdrukking van COX-2(cyclo-oxygenase)eiwit en mRNA en (ii) het effect van COX-2(cyclo-oxygenase)remmer celecoxib op dehypoxie-geïnduceerde toename van iPGE, onze resultaten gaven aan dat:hypoxiebepaald op een tijdelijke manier transcriptionele opregulatie van COX-2(cyclo-oxygenase)uitdrukking (Fig. 3a,b)en dat COX-2(cyclo-oxygenase)remming dempte de toename van iPGE, in HK-2-cellen onderhypoxie(Fig. 3c). interessant,hypoxiebepaalde ook tijdelijke opregulatie van mPGES -1 eiwitexpressie (Fig, 3a, inzet), maar had geen invloed op mPGES -1 mRNA-expressie (Fig, 3b. inzet). Deze resultaten gaven aan dat verhoogde expressie van COX-2(cyclo-oxygenase)en mPGES-1 is verantwoordelijk voor dehypoxie-geïnduceerde toename van iPGE.

Figuur 3. HIF-la-afhankelijke transcriptionele regulatie van COX-2(cyclo-oxygenase)genexpressie draagt ​​bij aan de door hypoxie geïnduceerde toename van iPGE, in proximale tubulaire HK-2-cellen.(a)De uitdrukking van COX-2(cyclo-oxygenase)eiwit wordt tijdelijk verhoogd doorhypoxie(Western-blot-analyse). Inzet: Expressie mPGES-1-eiwit wordt ook tijdelijk opwaarts gereguleerd doorhypoxie. (b)Uitdrukking COX-2(cyclo-oxygenase)mRNA wordt tijdelijk verhoogd methypoxie. Inzet: Expressie van mPGES-1 mRNA wordt niet beïnvloed doorhypoxie. (c)Preventie door celecoxib, een COX-2(cyclo-oxygenase)remmer, van de toename van iPGE, geïnduceerd doorhypoxie. Cellen werden gedurende 1 uur voorgeïncubeerd met 3 M celecoxib. Links-PGE,-afhankelijke immunofluorescentie alleen of samengevoegd met nucleaire kleuring met DAPI wordt getoond (oorspronkelijke vergroting, 40 ×). Rechts: kwantitatieve benadering van de afbeeldingen in het linkerdeelvenster met behulp van Image J-software. (d) Bijdrage van transcriptionele mechanismen. Links: Transcriptionele remmer actinomycine D (Act. D) voorkomt ahypoxie-geïnduceerde toename van COX-2(cyclo-oxygenase)eiwitexpressie (Western-blot-analyse). Cellen werden gedurende 1 uur voorbehandeld met 1 ug/ml Act. D alvorens te worden blootgesteld aanhypoxiegedurende 3 uur.Rechts: Toename van de activiteit van een COX-2(cyclo-oxygenase)verslaggever constructie. (e) Remmer van HIF-la YC-1 voorkomthypoxie-geïnduceerde transcriptionele COX-2(cyclo-oxygenase)opregulering. Cellen werden 1 uur voorgeïncubeerd met 0,5 uM YC-1. Links: Preventie van COX-2(cyclo-oxygenase)opregulering. Cellen werden blootgesteld aanhypoxievoor 8 u. Centrum: Voorkomen van de toename van de activiteit van een COX-2(cyclo-oxygenase)verslaggever constructie. Rechts: Remming van de activiteit van een HRE-gedreven reporterconstructie. Cellen werden blootgesteld aanhypoxiegedurende 8 uur. (f) HIF-la-remmer YC-1 verhoogt apoptotische celdood (flowcytometriestudies). Voordat u wordt blootgesteld aan:hypoxie, cellen werden gedurende 1 uur voorgeïncubeerd met 0,5 μM YC-1. Inzet∶ YC-1 remt dehypoxie-geïnduceerde toename van HIF-1a-expressie (Western-blot-analyse). Algemene informatie: (1) Cellen werden 24 uur geïncubeerd in normoxische (21 procent O,) of hypoxische (1 procent O,) omstandigheden, zoals aangegeven in "Methoden". (2) Microfoto's zijn representatieve voorbeelden van drie onafhankelijke experimenten. (3) Western-blot-analyse: gelijk eiwit werd bevestigd door sonderen met een anti-- -actine-antilichaam (4) Staven en foutbalken in grafieken: elke balk vertegenwoordigt het gemiddelde ± SEM van 3 verschillende experimenten *P<0.01 vs.="" other="">

Om de bijdrage van transcriptionele mechanismen aan de toename van COX verder te onderzoeken-2(cyclo-oxygenase)eiwitexpressie onderhypoxie, uitdrukking van COX-2(cyclo-oxygenase)werd beoordeeld in HK-2-cellen, die vooraf waren geïncubeerd met de transcriptieremmer actinomycine D voordat ze werden onderworpen aanhypoxievoor 5 u. Zoals getoond in Fig.3d,hypoxie-geïnduceerde toename van COX-2(cyclo-oxygenase)eiwitexpressie werd voorkomen door actinomycine D. Bovendien,hypoxiebepaalde ook een toename van de activiteit van een COX-2(cyclo-oxygenase)promotorconstruct eerder getransfecteerd in HK-2-cellen (Fig. 3d rechts). Alles bij elkaar genomen suggereren de resultaten getoond in Fig. 3d dat transcriptionele mechanismen bijdragen aan ahypoxie-geïnduceerde toename van COX-2(cyclo-oxygenase)eiwit expressie. Desalniettemin was er een discrepantie tussen de timing van de activering van de COX-2-promotor en de timing van de maximale COX-2(cyclo-oxygenase)mRNA-expressie: terwijl de tijdelijke toename van COX-2(cyclo-oxygenase)mRNA-expressie was maximaal na 2 uur (Fig.3b), de COX-2-promotor werd geactiveerd na 3 uur (Fig.3d), wat waarschijnlijk de bijdrage van post-transcriptionele mechanismen aan de toename van COX weerspiegelt{{6 }}(cyclo-oxygenase)uitdrukking4. Dienovereenkomstig speculeren we dat COX-2(cyclo-oxygenase)mRNA is gestabiliseerd onderhypoxie, wat zou resulteren in verhoogde COX-niveaus-2(cyclo-oxygenase)mRNA-expressie zonder enige bijdrage (op dat moment) van verhoogde activiteit van de COX-2(cyclo-oxygenase)promotor. Het is echter ook mogelijk dat een tijdsverloop tussen activering van de promotor en accumulatie van meetbaar substraat ook kan bijdragen aan de discrepantie tussen de timing van de activering van de COX-2-promotor en de timing van maximale COX{{1 }}(cyclo-oxygenase)mRNA-expressie.

HIF-1 is een heterodimere transcriptiefactor die is samengesteld uit de zuurstofafhankelijke -subeenheid en de constitutief tot expressie gebrachte -subeenheid. Onderhypoxie, HIF-l accumuleert en gaat de kern binnen, waar het de transcriptiefactor HIF-1 genereert na dimerisatie met HIF-1 . HIF-1 bevordert vervolgens de expressie van zijn doelgenen door te binden aanhypoxie-responsieve elementen (HRE's) aanwezig in hun regulerende regio en orkestreert vervolgens cellulaire adaptieve reacties om te bestrijdenhypoxie 3. Gezien het feit dathypoxiekan COX activeren-2(cyclo-oxygenase)expressie op een HIF-1-afhankelijke manier via een functionele HRE aanwezig in de COX-2-promotorsequentie2, we onderzochten de rol van HIF-l in eenhypoxie-geïnduceerde toename van COX-2(cyclo-oxygenase)uitdrukking. We hebben ook gekeken naar de activiteit van een COX-2-promotorconstruct getransfecteerd in HK-2-cellen. Zoals getoond in Fig. 3e, pre-incubatie met de HIF-1een remmer YC-1, die bottehypoxie-geïnduceerde toename in HIF-la-expressie en activiteit van een HRE-reporterconstruct, resulteerde in preventie van de toename in beide expressie van COX-2(cyclo-oxygenase)en activiteit van de COX-2(cyclo-oxygenase)promotorconstruct in HK-2 onderworpen aanhypoxie. Samengevat, de resultaten worden getoond in Fig.3a-e ondersteunen het idee dat HIF-1 -afhankelijke transcriptionele opregulatie van COX-2(cyclo-oxygenase)is verantwoordelijk voor dehypoxie-geïnduceerde toename van iPGE2.

Hoewel de gevolgen van de activering van HIF-1a onhypoxie-geïnduceerde apoptose controversieel is (waarschijnlijk omdat ze contextafhankelijk kunnen zijn), analyseerden we (op een voorlopige manier) de rol van HIF-1a in ons experimentele systeem. Aangezien we die interventie eerder hebben gevonden in de COX-2(cyclo-oxygenase)/iPGE, EP-receptorroute remt de toename van HIF-la-expressie veroorzaakt doorhypoxie8,56 vroegen we of remming van HIF-la resulteert in het voorkomen vanhypoxie-geïnduceerde HK-2 celapoptose. Zoals getoond in Fig. 3f, nam pre-incubatie met YC -1, een HIF-1-remmer, feitelijk toehypoxie-geïnduceerde apoptose. Daarom is het onwaarschijnlijk dat HlF-la

Discussie

Zakdoekhypoxiewordt van cruciaal belang geacht in de pathofysiologie van zowel chronische nierziekte als acuut nierletsel, aangezien PTC het meest gevoelige deel van niertubuli is tegenhypoxie. Hier onderzochten we de rol van PGE, in de schade die wordt toegebracht doorhypoxienaar menselijke PTC en ontdekte dat verhoogde productie van iPGE voortkwam uit HIF-la-afhankelijke opregulatie van COX-2(cyclo-oxygenase)genexpressie en verhoogde expressie van mPGES-1, draagt ​​bij aanhypoxie-geïnduceerde apoptotische celdood in HK-2-cellen. Aangezien tubulaire hypoxie een relevante factor is voor zowel acute als chronische nierziekte-2, wijzen deze resultaten erop dat prostaglandinetransporter PGT een nieuw therapeutisch doelwit is bij nieraandoeningen.

Hypoxieverhoogt niet alleen iPGE, maar ook de afgifte ervan aan het extracellulaire medium8, zodat uitgescheiden (extracellulair) PGE ook een rol kan spelen bijhypoxie-geïnduceerde apoptose (bijvoorbeeld het activeren van apoptotische cascades door de canonieke activering van EP-receptoren die zich op het celmembraan bevinden). Twee eerdere onderzoeken hebben aangetoond dat celdood onderhypoxiewas ook te wijten aan COX-2(cyclo-oxygenase)-afhankelijke productie van PGE,1345. Aan de andere kant wordt in bepaalde celtypen (fibroblasten, microglia, neuronen en acute lymfoblastische leukemiecellijnen) PGE.-geïnduceerde apoptose gemedieerd door PGE-afhankelijke activering van EP-receptoren46-48. We hebben hier gevonden dathypoxie-geïnduceerde HK-2-celapoptose werd ook voorkomen door antagonisme van EP-receptoren (Fig. 2a, bovenste paneel, rechts). Maar omdat EP-receptoren klassiek zijn beschreven als plasmamembraanreceptoren - zodat ze ontoegankelijk zijn voor iPGE2-, speculeren we dat de EP-receptoren die het apoptotische effect van iPGE mediëren, in hypoxische HK-2-cellen een subset die zich intracellulair bevindt (dwz iEP-receptoren).

In tegenstelling tot de rol van iPGE2 inhypoxie-geïnduceerde apoptose in HK-2-cellen, vonden we dat alleen extracellulair PGE medieerthypoxie/reoxygenatie-geïnduceerde HK-2 celdood omdat het niet werd voorkomen door remmers van PGT (Fig. 2f). Hoewel de pathologische mechanismen van cellulair letsel nahypoxie/reoxygenatie niet volledig worden begrepen, wordt aangenomen dat celdood grotendeels plaatsvindt door de productie van overmatige reactieve zuurstofsoorten (ROS). Dit geldt met name voor HK-2-cellen49,50. Echter, hoewelhypoxiekan ook de productie van ROS verhogen, voor zover wij weten is er geen bewijs dat ROS een relevante inhypoxie-geïnduceerde dood van HK-2-cellen. Dit suggereert dat de dodelijke effecten van hypoxie en hypoxie/reoxygenatie in HK-2-cellen worden gemedieerd door verschillende mechanismen, wat zou kunnen verklaren waarom BG en BS beschermend zijn tegenhypoxiemaar niet tegenhypoxie/reoxygenatie. Bijgevolg zou remming van PGT therapeutische voordelen kunnen bieden bij PTC tegen door hypoxie geïnduceerde celbeschadiging, maar niet tegen het schadelijke effect vanhypoxie/reoxygenatie.

HIF-1 -afhankelijke opregulering van COX-2(cyclo-oxygenase)was een kritieke gebeurtenis voorhypoxie-geïnduceerde HK-2 celapoptose (Fig. 3e). Onze waarneming dat HIF-remmer YC -1 de apoptotische celdood verhoogde (Fig. 3f) is echter raadselachtig, hoewel eerdere rapporten al vergelijkbare resultaten hebben laten zien . Een mogelijke verklaring is een hypothetisch scenario waarin HIF-la niet alleen de pro-apoptotische opregulatie van COX bemiddelt-2(cyclo-oxygenase)maar ook de opregulering van beschermende moleculen. Inderdaad, HIF-1-reguleerde de expressie van beschermende moleculen tegen:hypoxiezoals lang niet-coderend RNA DARS-AS1'en microRNA-2103 is specifiek gevonden in HK-2-cellen. Hoewel deze bewijsstukken ons hypothetische scenario ondersteunen, moeten er echter specifieke experimenten worden uitgevoerd om dit te bevestigen.

Onderzoek naar de reactie van niercellen ophypoxiekan ons begrip van nierpathologie verbeteren. We hebben, hoewel op een voorlopige manier, de rol bestudeerd van een toename van de pro-apoptotische eiwit Bax tot anti-apoptotische eiwit Bcl-2-expressieverhouding inhypoxie-geïnduceerde apoptose in HK-2-cellen. Onze resultaten gaven aan dat remming van PGL niet resulteerde in veranderingen die verenigbaar zijn met een anti-apoptotische verschuiving in de balans tussen de expressie van Bcl-2 en Bax (Fig.2e), wat de rol van deze eiwitten in iPGE-afhankelijke HK-2 celdood onderhypoxie. Voor zover ons bekend zijn er slechts twee onderzoeken naar de implicatie van de Bcl{{0}}/Bax-as bij door hypoxie geïnduceerde apoptose bij PTC en beide hadden betrekking op anoxische" of bijna anoxische O-concentraties5 Wanneer PTC werd blootgesteld aan 0,2 procent O., bleef de Bax-expressie onveranderd en was apoptose gekoppeld aan een verminderde Bcl-2-expressiegraad. De expressie van Bcl-2 werd echter niet beïnvloed door 1 procent O, ondanks de aanwezigheid van apoptose, wat samenvalt met onze resultaten.Daarom moeten andere mechanismen worden overwogen die niet noodzakelijkerwijs kwantitatieve veranderingen in Bcl-2 of Bax-expressie inhouden: inductie van apoptose in gekweekte glioomcellen door iPGE2 vereist bijvoorbeeld alleen de fysieke associatie met Bax, die de translocatie van Bax naar mitochondriën veroorzaakt.202 Het mechanisme waardoor iPGE bijdraagt ​​aan HK-2 celapoptose verdient dus verder onderzoek.

Onze groep heeft geconstateerd dat een COX-2(cyclo-oxygenase)-afhankelijke toename van iPGE, bemiddelt apoptotische dood in HK-2-cellen die zijn blootgesteld aan cisplatine', apoptotische lichamen7" enhypoxie(onze huidige resultaten). Omdat PGE snel aan de buitenkant van de cel wordt afgegeven nadat het is gekleineerd2, speelt het binnenwaartse transport door PGl een cruciale rol bij door iPGE geïnduceerde apoptose in HK-2-cellen. Daarom, wanneer die PTC-schade wordt gemedieerd door iPGE, kan behandeling met remmers van PGT een nuttige therapeutische benadering zijn met mogelijke toepassingen zoals preventie van door cisplatine geïnduceerde PTC-schade, remming van de verspreiding van tubulaire schade door apoptotische lichamen, of beperking van de schadelijk effect vanhypoxieop PTC.