Totale glycosiden van Cistanche Deserticola bevorderen herstel van neurologische functies door neurovasculaire regeneratie te induceren via Nrf- 2/Keap-1 Pathway bij MCAO/R-ratten-Ⅰ

INVOERING

Beroertes worden beschouwd als een belangrijke doodsoorzaak en invaliditeit in de wereld. Bijna 87% van alle gevallen van beroerte wordt veroorzaakt door een ischemische beroerte. Momenteel is dit het meest effectieve middel en het enige door de FDA goedgekeurde medicijn dat hiervoor wordt gebruiktischemische beroerte behandelingis een recombinante weefselplasminogeenactivator. Een groot aantal patiënten met een beroerte reageert echter niet op dit medicijn, vanwege het korte therapeutische tijdsbestek en het ernstige risico op hemorragische complicaties. Een grote uitdaging bij trombolytische behandeling is ischemie/reperfusie (I/R)-letsel, dat wordt beschouwd als een hoofdoorzaak van hersenletsel en functievernietiging. Reperfusie na cerebrale ischemie verhoogt het risico op een hersenbloeding, leidt tegelijkertijd tot neurovasculair letsel en produceert overmatige reactieve zuurstofsoorten (ROS) die de bloed-hersenbarrière beschadigen. Verschillende onderzoeken hebben bevestigd dat de verstoring van de BBB een belangrijke oorzaak is van de pathogenese van ischemische beroerte.

NATUURLIJKE CISTANCHE TUBULOSA VOOR DE BEHANDELING ISCHEMISCHE beroerte PHGS75% ECH 30% ACT 12%

De BBB bestaat voornamelijk uit endotheelcellen, pericyten, astrocyten, neuronen en de basale membranen. De kerncomponenten van de BBB zijn cerebrale microvasculaire endotheelcellen die met elkaar verbonden zijn door nauwe verbindingen, waardoor exogene moleculen in de hersenen worden beperkt. De pathologische veranderingen van tight kruispunten - in het bijzonder occludin, claudin-5 en zonula occludens-1 (ZO-1) - hebben een significante invloed op de BBB-functie tijdens een ischemische beroerte, met name de permeabiliteit van de barrière. Tijdens I/R-perioden is overmatige ROS een van de belangrijkste factoren die leiden tot directe schade aan hersenneuronen. Overproductie van ROS leidt tot de afbraak van bepaalde knooppunten en verstoring van de BBB, wat ertoe leidt dat exogene moleculen via de BBB de hersenen binnendringen, wat leidt tot verergering van hersenbeschadiging. Daarom wordt bescherming van de BBB door antioxidanten beschouwd als een mogelijke manier om reperfusieschade te voorkomen.

Naast de afbraak van de BBB kan I/R resulteren in neurovasculair letsel en neuronale dood. Tijdens een beroerte kan een verhoogde neuronale celdood het gevolg zijn van oxidatieve stress en talrijke onderzoeken hebben aangetoond dat ROS de ernst van een beroerte en neurologische schade verergert. Hoewel klinische onderzoeken geen bevredigende resultaten hebben opgeleverd, is neuroprotectie nog steeds een veelbelovende strategie voor de behandeling van acute ischemische beroerte. Het vinden van effectieve neuroprotectieve medicijnen om beroertes te behandelen is dus een voordeel voor patiënten met een beroerte.

Traditionele Chinese geneeskunde (TCM) neemt maatregelen om in te grijpen tegen de interne onbalans van het lichaam. Vanwege de complexe pathogenese van ischemische beroertes spelen het multifactoriële effect van TCM en de actieve bestanddelen ervan een cruciale rol bij de behandeling van beroertes.Cistanchedeserticola YC Ma, wijdverspreid in dorre of semi-aride gebieden in Mongolië en Noordwest-China, is al meer dan 1,000 jaar een veelgebruikt TCM-kruid voor de behandeling van verschillende ziekten zoals vergeetachtigheid en depressie in China. Moderne farmacologische onderzoeken hebben aangetoond dat de ruwe extracten van C. deserticola meerdere farmacologische activiteiten vertoonden, zoalsverbetering van de leer- en geheugenfunctie, neuroprotectie, immuniteit, antioxiderende, anti-verouderings- en antivermoeidheidseffecten. Chemische analyse van C. deserticola toonde aan dat de belangrijkste bestanddelen ervan omvattenfenylethanoïde glycosiden, iridoïde glycosiden, polysachariden en oligosachariden. De actieve componenten van C. deserticola voor hersenbescherming zijn echter niet erg duidelijk.

De neuroprotectieve eigenschap van C. deserticola impliceert zijn therapeutisch potentieel bij cognitieve ziekten zoals beroerte en depressie, evenals de ziekte van Alzheimer. Onderzoek naar de impact van C. deserticola op beroertes, inclusief de actieve componenten en werkingsmechanismen, is echter zeer beperkt. In het huidige werk onderzochten we het beschermende effect van drie extracten van C. deserticola, totale glycosiden (TG's, fenylethanoïde glycosiden en andere glycosiden), polysachariden (PS's) en oligosachariden (OS's) op cerebrale I/R-letsels. Onze bevindingen kunnen bijdragen aan de nauwkeurige klinische toepassing van C. deserticola en een kandidaat-middel opleverenischemische beroerte-therapie.

MATERIALEN EN METHODES

Chemicaliën en reagentia

De stengels van Cistanche deserticola werden gekocht bij Alashan, Binnen-Mongolië, en geïdentificeerd door een van de auteurs (P.-F. Tu). TG's, PS's en OS's werden voorbereid volgens onze eerder gerapporteerde methode. Kwantitatieve analyse van TG's werd uitgevoerd door middel van hogedrukvloeistofchromatografie (HPLC) zoals eerder beschreven, en het chromatogram ervan wordt getoond in Figuur 1. De belangrijkste componenten van TG's zijn echinacoside, tubuloside A, acteoside, isoacteoside en 2'-acetylacteoside; hun inhoud is respectievelijk 163,05 mg/g, 4,125 mg/g, 41,66 mg/g, 22,655 mg/g en 12,045 mg/g. Het gehalte aan PS's en OS's bedraagt ​​respectievelijk 69,42% en 65,24%, zoals bepaald met respectievelijk HPLC en de fenol-zwavelzuuranalyse.

NATUURLIJKE CISTANCHE TUBULOSA VOOR DE BEHANDELING VAN ISCHEMISCHE CERTIFICATEN PHGS75% ECH 30% ACT 12%

De standaardreferenties van echinacoside (A0282), tubuloside A (A0942), acteoside (A0280), isoacteoside (A0281) en 2'-acetylacteoside (A0943) werden gekocht bij Chengdu Must Biotechnology. De zuiverheid van alle standaarden bedraagt ​​meer dan 98%. Nissl vlek-H&E-kits zijn gekocht bij Boster. Edaravone (T0407-1) ​​werd gekocht van Target Mol (Shanghai, China). Er zijn konijnen-anti-ratten MAP-2 (ab32454), Nrf-2 (ab31163), PDGFRb (ab32570), Keap-1 (ab66620) en muizen-anti-ratten CD31 (ab24590) gekocht van Abcam Inc. Rabbit anti-rat Claudin5 (BS1069), ZO-1 (BS9802M) en Occludin (BS72035) werden gekocht van Bioworld Technology. Cell Signaling Technology Inc. (Boston, MA, VS) was de bron van konijn-anti-ratten Synapsin -1 (SYN,5297T), PSD95 (3450T), a-Smooth Muscle Actin (a-SMA,19245T). GAPDH (HRP-60004) werd gekocht bij Proteintech Group, Inc. Secundaire antilichamen werden geleverd door Zhongshan Golden Bridge Biotechnology (Beijing, China). Hoechst 33258 werd verkregen van Beyotime.

Dieren

Sprague-Dawley-ratten (mannelijk, met een gewicht van 250-300 g) werden verkregen van Vital River Laboratory Animal Technology en gehuisvest in een kamer met airconditioning die op een licht/donker-cyclus van 12 uur werd gehouden. Alle dierproeven werden uitgevoerd volgens de ARRIVE-richtlijnen voor dieronderzoek en goedgekeurd door het Institutional Animal Care and Use Committee van het Peking University Health Science Center.

Dierproefprotocollen

De ratten werden onderworpen aan MCAO/R, zoals eerder beschreven (Wang et al., 2018). In het kort werden de linker gemeenschappelijke halsslagader (CCA), de externe halsslagader (ECA) en de interne halsslagader (ICA) blootgelegd, en werd een 3-0 nylon monofilamenthechtdraad vanuit de ECA in de ICA ingebracht tot het midden werd bereikt. hersenslagader (MCA). Na 1,5 uur MCA-occlusie werd reperfusie gesimuleerd door het filament te verwijderen. Tijdens de chirurgische procedure werd de lichaamstemperatuur van alle ratten op 37,0 graden gehouden. Medicijn

Administratie

De ratten werden willekeurig in zes groepen verdeeld met behulp van de SPSS-softwareversie 22.0 zoals beschreven: normale groep (NOR); modelgroep (MOD); edaravongroep (positief geneesmiddel, 6 ml/kg, EDI); TG's-groep (280 mg/kg, TG's); PSs-groep (280 mg/kg, PSs) en OSs-groep (280 mg/kg, OSs). TG's, PS's en OS's werden gedurende 14 dagen eenmaal per dag toegediend na MCAO/R. De NOR- en MOD-groepen werden behandeld met een normale zoutoplossing. De dieraantallen zijn weergegeven in Tabel 1.

Meting van gewicht en gemodificeerde neurologische tekortscores (mNSS)

Het lichaamsgewicht werd op de 14e dag gevolgd met behulp van een ADVENTURE™ Digital Scale (OHAUS, New Jersey, VS). De mNSS werd beoordeeld volgens de methode beschreven door FJ Wang (Wang et al., 2018), met kleine herzieningen.

2, 3, 5-Trifenyltetrazoliumchloride (TTC) kleuring

Het infarctvolume werd gemeten zoals eerder beschreven. In het kort werden de hersenen in zeven op gelijke afstanden geplaatste coronale blokken (2 mm) verdeeld. Deze secties werden gedurende 15 minuten bij 37 graden gekleurd met 2% TTC. Infarctvolume (%)=(ipsilateraal ischemische hemisfeervolume − contralateraal ischemische hemisfeervolume)/contralateraal ischemische hemisfeervolume × 100.

Nissl en H&E-kleuring

De ratten werden diep verdoofd en de hele hersenen werden vervolgens snel uit de schedel verwijderd, gefixeerd met behulp van 4% paraformaldehyde ingebed in paraffinewas en in plakjes van 7 µm dikte gesneden. De coupes werden gekleurd met Nissl en H&E. In dit onderzoek werden zes willekeurige velden van 200 × 200 µm in elk weefselmonster vastgelegd met een lichtmicroscoop. Het aantal lichamen van Nissl werd geteld met IPP-softwareversie 6.0.

Evans Blue-test

Ratten werden na MCAO/R geïnjecteerd met 2% EB. Twee uur later werden de ratten verdoofd en werden de hele hersenen vervolgens snel verwijderd en gehomogeniseerd in aceton. De supernatanten werden geanalyseerd bij 620 nm met een 800 TS-absorptielezer.

Meting van de activiteiten van Catalase (CAT), Superoxide Dismutase (SOD), Malondialdehyde (MDA) en Glutathion Peroxidase (GSH-Px)

Alle serummonsters werden 15 minuten bij 4 graden gecentrifugeerd bij 4,000 x rpm en vervolgens geanalyseerd om de activiteiten van MDA, CAT, SOD en GSH-Px te detecteren volgens de instructies van de fabrikant.

Western-blotting-analyse

Hersenweefsels (100 mg) verzameld van elke rat werden gehomogeniseerd en gelyseerd in RIPA-lysebuffer en vervolgens geanalyseerd om de eiwitconcentratie te detecteren met behulp van een BCA-kit. Weefseltotale eiwitten werden op 10% SDS-PAGE-gels geladen en overgebracht op een nitrocellulosemembraan. Het membraan werd geblokkeerd met behulp van 5% magere melk en vervolgens een nacht bij 4 graden geïncubeerd met primaire antilichamen. Het membraan werd vervolgens geïncubeerd met een secundair antilichaam. Western blot-analyse werd geanalyseerd met behulp van Kodak Digital Imaging System.

Immunofluorescentieanalyse

Immunofluorescentiekleuring voor CD31, a-SMA, ZO-1, claudin5, occludin, PDGFRb, SYN, PSD95, MAP-2, Nrf-2 en Keap-1 werden uitgevoerd. Primaire antilichamen tegen Nrf-2, CD31, a-SMA, ZO-1, claudin5, occludin, PDGFRb, SYN, PSD95, MAP-2 en Keap-1 werden verdund tot 1 :20respectievelijk 0 en 1:100. De secundaire antilichamen van Alexa Flur 488 muis anti-konijn IgG en rhodamine (TRITC) geit anti-konijn IgG werden beide verdund tot 1:200. De kernen werden gekleurd met Hoechst 33258. Beelden werden vastgelegd met behulp van Vectra® Polaris ™ Automated Quantitative Pathology Imaging System (PerkinElmer, VS). De eiwitexpressie werd geanalyseerd met behulp van IPP-softwareversie 6.0. Statistische analyse

Alle gegevens werden beschreven als gemiddelde ± SD. SPSS-softwareversie 22.0 werd uitgevoerd voor statistische analyse. Bij het vergelijken van verschillende groepen werd eenzijdige ANOVA gebruikt. P < 0.05 werd beschouwd als het statistische verschil.

NATUURLIJKE CISTANCHE TUBULOSA VOOR ANTI-ISCHEMISCHE ZIEKTEN PHGS75% ECH 30% ACT 12%

RESULTATEN

TG's verhogen het lichaamsgewicht en verminderen de hersenschade bij MCAO/R-ratten

Na 14 dagen genezen met TG's, PS's, Oss en EDI werden het lichaamsgewicht, de neurologische tekorten en de infarctvolumes van I/R-ratten geëvalueerd. De resultaten toonden aan dat de lichaamsgewichten in de MOD-groep sterk waren afgenomen, terwijl de afgenomen gewichten in de TG's, PS's en EDI-groepen waren toegenomen (Figuur 2A). Neurologische tekortscores werden aanzienlijk verlaagd door EDI en TG's (Figuur 2B). De hersenplakjes bij ratten uit de NOR-groep waren dieprood en er waren geen infarcten, terwijl de ratten uit de MOD-groep een groot ipsilateraal herseninfarct vertoonden. Na behandeling met TGs waren de infarctvolumes aanzienlijk verminderd (figuren 2C, D). De behandeling met PS's en OS's vertoonde geen duidelijk effect op de bovengenoemde indexen. Uit de bovenstaande gegevens bleek dat TG's de door I/R geïnduceerde hersenbeschadiging aanzienlijk konden verlichten, maar PS's en OS's niet.

TG's verbeteren histopathologische schade bij MCAO / R-ratten

Om enkele effecten van de behandeling met TG's, PS's en OS's op histopathologische schade te bepalen, werd H&E-kleuring uitgevoerd om pathologische schade aan het licht te brengen. De histomorfologische structuren van de hersenen in de NOR-groep waren regelmatig gerangschikt. De morfologieveranderingen in de TGs-groepen waren kleiner dan die in de MOD-groep. De behandelingsgroepen met PS en OS vertoonden echter geen significante verbetering van de morfologieveranderingen (Figuur 3).

TG's verzwakken neuronale schade na I/R-geïnduceerde ratten

Nissl-kleuring toonde de histopathologische veranderingen van neuronen in de penumbra van het ischemische gebied. Zoals weergegeven in Figuur 4 hadden de normale neuronen een duidelijke nucleolus en een intacte structuur. In de MOD-groep hadden de neuronen vergrote intercellulaire ruimtes. De Nissl-lichamen verdwenen, gekrompen en diep besmeurd. Deze veranderingen werden echter zelden waargenomen in de EDI-, TG’s- en PS-groepen. Deze resultaten illustreerden dat TG's en PS's dit aanzienlijk konden doenverzwakken door ischemie/reperfusie geïnduceerde neuronale schade.

TG's verzwakken de verstoring van de BBB na I/R-behandelde ratten

Evans Blue-assay is een klassieke methode voor het onderzoeken van de verandering van de BBB-permeabiliteit. De experimentresultaten toonden aan dat er een toename van Evans-blauw werd waargenomen in de MOD-groep, terwijl er een significant afname van Evans-blauw was bij de TG's en met EDI behandelde ratten. Bovendien was er geen significant verschil tussen PS- en OS-therapiegroepen (Figuur 5). Deze resultaten suggereerden dat TG's de verstoring van de BBB aanzienlijk zouden kunnen verminderen.

TG's bevorderen angiogenese bij I/R-gewonde ratten

Recentere onderzoeken tonen aan dat angiogenese een cruciale rol speelt bij neurologisch functioneel herstel en prognostische uitkomsten na een acute ischemische beroerte (Yuen et al., 2015). Om de effecten van TG's, PS's en OS's op angiogenese te evalueren, werden de CD31 en a-SMA gebruikt om de capillaire aantallen te kwantificeren. Immunofluorescentiekleuring toonde aan dat de MOD-groep een opmerkelijke afname veroorzaakte in de expressies van CD31 (figuren 6A, B) en a-SMA (figuren 6C, D) in de penumbra van ischemische gebieden van I/R-ratten, in vergelijking met de normale ratten . Dit resultaat illustreerde dat I/R vasculaire schade zou kunnen veroorzaken in de cortex penumbra van ischemische hemisferen. De behandeling met TG's en EDI verhoogde echter opmerkelijk de capillaire dichtheid, angiogenese en arteriogenese, zoals aangegeven door verhoogde expressies van CD31 en a-SMA. Deze resultaten suggereren dat TG's angiogenese in de ischemische penumbra van I/R-ratten zouden kunnen bevorderen, maar de PS's en OS's niet.

TG's verhogen de expressie van tight-junction-eiwitten bij I/R-gewonde ratten

Een verstoring van de BBB kan het watergehalte in de hersenen en de zwelling van het weefsel verhogen, wat kan leiden tot hersenletsel. Tight junctie-eiwitten zijn belangrijke structurele componenten van de BBB. Om te testen of behandeling met TG's, PS's en OS's na een beroerte de integriteit van de BBB zou kunnen beïnvloeden, werden de expressies van ZO-1, claudine-5 en occludine uitgevoerd door middel van immunofluorescentieanalyse. De resultaten gaven aan dat de expressies van claudin-5, occludin en ZO-1 zichtbaar verminderd waren in de MOD-groep. Ze namen echter aanzienlijk toe na 14 dagen toediening. PSs- en OSs-groepen vertoonden geen significante veranderingen in deze eiwitexpressies (Figuur 7). Deze gegevens gaven aan dat de TG's de expressie van tight-junction-eiwitten kunnen reguleren en waarschijnlijk de BBB-integriteit kunnen behouden na I/R-letsel.

TG's verhogen de dekking van pericyten op haarvaten bij I/R-gewonde ratten

Pericytendekking op haarvaten speelt een cruciale rol bij het handhaven van de BBB-integriteit. Daarom hebben we getest of de pericytendekking kan worden verhoogd door behandeling met TG's, PS's en OS's. De resultaten van de immunofluorescentie-intensiteitsanalyse toonden aan dat zowel de PDGFRb- als de CD31-expressies dramatisch waren afgenomen in de MOD-groep. Toediening van TG's aan de I/R-ratten herstelde of verhoogde de expressie-intensiteiten van de PDGFRb en ​​CD31 aanzienlijk, maar er werd geen verschil waargenomen in de behandelingsgroepen met PS en OS (Figuur 8). Behandeling van TG's zou de dekking van pericyten dus aanzienlijk kunnen vergroten. Deze bevindingen bevestigden verder dat TG's de integriteit van BBB na I/R kunnen behouden.

NATUURLIJKE CISTANCHE TUBULOSA VOOR HET VOORKOMEN VAN EEN ISCHEMISCHE BEROEP PHGS75% ECH 30% ACT 12%