Zerumbone, een tropisch gember-sesquiterpeen van Zingiber Officinale Roscoe, verzwakt door MSH geïnduceerde melanogenese in B16F10-cellen Deel 1

Abstract:Van Zerumbone (ZER), een actief bestanddeel van de Zingiberaceae-familie, is aangetoond dat het verschillende biologische activiteiten vertoont, zoals ontstekingsremmend, antiallergisch, antimicrobieel en kankerbestrijdend; het is echter niet onderzocht op anti-melanogene eigenschappen. In de huidige studie laten we zien dat ZER en Zingiber officinale (ZO) extracten zijn die de melanine-accumulatie in -melanocyt-stimulerend hormoon (-MSH)-gestimuleerde melanogene B16F10-cellen van de muis aanzienlijk verminderen. Verder, om het moleculaire mechanisme te verhelderen waarmee ZER melanine-accumulatie onderdrukt, analyseerden we de expressie van de melanogenese-geassocieerde transcriptiefactor, microphthalmia-geassocieerde transcriptiefactor (MITF) en zijn doelgenen, zoals tyrosinase, tyrosinase-gerelateerd eiwit 1 ( TYRP1), en tyrosinase-related protein 2 (TYRP2), in B16F10-cellen die worden gestimuleerd door -MSH. Hier ontdekten we dat ZER de MITF-gemedieerde expressie van melanogene genen remt bij -MSH-stimulatie. Bovendien vertoonden cellen die werden behandeld met verschillende concentraties zerumbone en ZO verhoogde extracellulaire signaalgereguleerde kinasen 1 en 2 (ERK1/2) fosforylering, die betrokken zijn bij het afbraakmechanisme van MITF. Farmacologische remming van ERK1/2 met behulp van U0126 heeft het anti-melanogene effect van ZER voldoende omgekeerd, wat suggereert dat verhoogde fosforylering van ERK1/2 vereist is voor zijn anti-melanogene activiteit. Alles bij elkaar genomen, suggereren deze resultaten dat ZER- en ZO-extracten kunnen worden gebruikt als actieve ingrediënten in huidblekende cosmetica vanwege hun anti-melanogene effect.

Volgens relevante studies is cistanche een veel voorkomend kruid dat bekend staat als "het wonderkruid dat het leven verlengt". Het hoofdbestanddeel iscistanoside, wat verschillende effecten heeft, zoalsantioxidant,ontstekingsremmend, en bevordering van de immuunfunctie. Het mechanisme tussencistancheEnbleken van de huidligt in het antioxiderende effect van cistancheglycosiden. Melanine in de menselijke huid wordt geproduceerd door de oxidatie van tyrosine gekatalyseerd doortyrosinase, en de oxidatiereactie vereist de deelname van zuurstof, dus de zuurstofvrije radicalen in het lichaam worden een belangrijke factor die de melanineproductie beïnvloedt. Cistanche bevat cistanoside, dat een antioxidant is en zo de vorming van vrije radicalen in het lichaam kan verminderenremming van de productie van melanine.

Klik op Hoe Cistanche gebruiken

Voor meer informatie:

david.deng@wecistanche.com WhatsApp:86 13632399501

Trefwoorden:zerumbone; Zingiber officiële Roscoe; melanogenese; MITF; ERK1/2

1. Inleiding

Melanogenese, de productie van melanine door epidermale melanocyten, wordt gestimuleerd door het -melanocytstimulerend hormoon (-MSH) dat door keratinocyten wordt uitgescheiden bij blootstelling aan ultraviolette (UV) straling [1,2]. De stamcelfactor (SCF) is een andere melanogene factor die de migratie, proliferatie en differentiatie van melanocyten strikt regelt om postnatale huidmelanogenese in stand te houden [3]. Microphthalmia-associated transcription factor (MITF), een melanogene transcriptiefactor, wordt geactiveerd via de cAMP-PKA-CREB (cyclic adenosine monophosphate-protein kinase A-cAMP response element binding protein) signaalroute na -MSH-stimulatie via melanocortine 1-receptor (MC1R) in cytoplasmatische membranen van epidermale melanocyten [4]. Van verschillende chemicaliën, zoals forskolin en IBMX (3-isobutyl-1-methylxanthine), is bekend dat ze de cAMP-PKA-CREB-signaalroute activeren, wat leidt tot de inductie van melanogenese [5]. Verschillende onderzoeken hebben aangetoond dat aanhoudende activering van extracellulair gereguleerde kinasen 1 en 2 (ERK1/2), die betrokken zijn bij het moleculaire mechanisme van oncogenese, MITF-fosforylering op Ser73 bevordert en de daaropvolgende afbraak via ubiquitine-afhankelijke proteolyse [6,7 ]. Van U0126, een selectieve remmer van de ERK1/2-route, is inderdaad gerapporteerd dat het de MITF-expressie en tyrosinase-activiteit verhoogt, wat leidt tot melanineproductie [6]. Gestabiliseerde en geactiveerde MITF verhoogt de expressie van melanogene genen, zoals tyrosinase, tyrosinase-related protein 1 (TYRP1) en tyrosinase-related protein 2 (TYRP2). De omzetting van tyrosine in 3,4-dihydroxyfenylalanine (L-DOPA), de eerste stap van melanogenese, wordt gekatalyseerd door tyrosinase. Tyrosinase-gerelateerde eiwitten (TRP's) katalyseren verdere oxidatie- en tautomerisatiereacties [8]. Na melaninesynthese wordt volwassen melanine getransporteerd van epidermale melanocyten naar het cytoplasma van de basale keratinocyten om cellen te beschermen tegen UV-straling [2].

Abnormaal verhoogde melanogenese veroorzaakt meerdere soorten huidaandoeningen, zoals huidkanker, chloasma en sproeten [4]; daarom zijn kleine moleculen of natuurlijke producten die gericht zijn op ofwel de katalytische activiteit van tyrosinase, ofwel regulatoren van signaalroutes in melanogenese, waaronder ERK1/2, of MITF-gemedieerde transcriptie van melanogene genen, geïdentificeerd als actieve ingrediënten die in de cosmetica kunnen worden gebruikt. industrie. Verschillende kleine moleculen, zoals kojiczuur, arbutine en niacinamide, worden veel gebruikt als cosmetische ingrediënten vanwege hun anti-melanogene activiteiten. Rapporten hebben echter aangetoond dat kojiczuur vanwege zijn genotoxische activiteit meerdere bijwerkingen veroorzaakt, waaronder cytotoxiciteit, dermatitis, huidkanker en hepatocellulair carcinoom [9]. Hoewel arbutine, geïsoleerd uit de berendruif, is gebruikt om hyperpigmentatiestoornissen te behandelen, is het gebruik ervan als cosmetisch ingrediënt onlangs beperkt vanwege de verschillende bijwerkingen [9]. Er is gemeld dat niacinamide een anti-melanogene activiteit heeft en deze activiteit wordt uitgevoerd door de overdracht van melanosomen van melanocyten naar omliggende keratinocyten te remmen [10]. Daarom wordt het over het algemeen gebruikt als huidbleekmiddel in de cosmetische industrie. Om de beperkingen van gevestigde huidbleekmiddelen die verschillende bijwerkingen hebben te overwinnen, is het belangrijk om veilige ingrediënten voor het bleken van de huid te ontwikkelen die zijn afgeleid van natuurlijke bronnen. Zo zijn -thujaplicine, linderanolide B, 4-butylresorcinol en plumbagin geïdentificeerd als anti-melanogene verbindingen vanwege hun tyrosinase-remmende effecten [4,11]. Nobiletine, withaferine A, sesamol en chaetocine vertonen anti-melanogene eigenschappen door het moduleren van signaaltussenproducten in de melanogeneseroute [11].

Zerumbone (ZER) is een natuurlijk product dat wordt geïsoleerd uit de vluchtige essentiële oliën van planten die behoren tot de Zingiberaceae-familie, zoals Zingiber zerumbet Smith en Zingiber officinal Roscoe [12]. Verschillende onderzoeken hebben aangetoond dat ZER een breed scala aan biologische activiteiten heeft, waaronder antimicrobiële, antioxiderende, antidiabetische, kankerbestrijdende, ontstekingsremmende, antiallergene en anti-angiogene activiteiten [12]. Interessant is dat is aangetoond dat ZER een beschermend effect heeft tegen door ultraviolet A (UVA) geïnduceerde oxidatieve schade in huidkeratinocyten, vanwege het vermogen om reactieve zuurstofspecies (ROS) op te vangen via de activering van nucleaire factor-E{{8} }gerelateerde factor-2 (Nrf2) [1,13]. Dit suggereert dat ZER kan worden gebruikt als een functioneel additief in huidverzorgingscosmetica. Het gedetailleerde mechanisme van de anti-melanogene eigenschappen van ZER-actie moet echter nog worden bestudeerd.

In de huidige studie werden de remmende effecten van ZER en Zingiber officinal (ZO) -extract op -MSH-gestimuleerde melanogenese en hun onderliggende mechanismen bestudeerd. Hier laten we zien dat ZER door MSH geïnduceerde melanogenese significant onderdrukt door de fosforylering van ERK1/2 op te reguleren en MITF-gemedieerde expressie van melanogene genen te remmen.

2. Resultaten

2.1. Zerumbone (ZER) onderdrukt door MSH geïnduceerde melanogenese in B16F10 muizenmelanoomcellen

Om het anti-melanogene effect van zerumbone (ZER) te bestuderen, evalueerden we aanvankelijk de cytotoxiciteit ervan in zowel B16F10- als HaCaT-cellen. De chemische structuur van ZER wordt weergegeven in figuur 1A. Er werd waargenomen dat ZER bij concentraties boven 20 µM een sterk cytotoxisch effect vertoonde, terwijl ZER bij concentraties onder 20 µM geen cytotoxiciteit vertoonde in beide cellijnen (Figuur 1B). Vervolgens onderzochten we de remmende effecten van ZER op -melanocyten stimulerend hormoon (-MSH)-geïnduceerde melanine-accumulatie en secretie in B16F10-cellen. ZER bleek de -MSH-geïnduceerde intracellulaire accumulatie van melanine en de uitscheiding ervan in het kweekmedium sterk te onderdrukken (Figuur 1C, D). Bovendien ontdekten we dat ZER melanogenese effectiever verzwakt dan 1 mM arbutine of 0,2 mM kojiczuur, de bekende actieve bestanddelen van huidblekende cosmetica (Figuur 1D). Om te verduidelijken of ZER voldoende is om melanogenese in menselijke cellen te onderdrukken, hebben we melanine-producerende G361 menselijke melanoomcellen gebruikt. Zoals weergegeven in figuur 1E, verlaagt ZER de door stamcelfactor (SCF) geïnduceerde extra- en intracellulaire melanine-inhoud aanzienlijk. Deze resultaten bevestigen de anti-melanogene activiteit van ZER in melanogene muizen-B16F10- en menselijke G361-cellen.

2.2. Zerumbone onderdrukt genexpressie van melanogenese-transcriptiefactor, MITF en zijn doelgenen in G361 menselijke melanoomcellen 

Van endotheline-1 en SCF-signalering is gemeld dat ze een essentiële rol spelen bij de melanogenese in menselijke melanocyten en verschillende subtypes van melanoom [3,14-16]. In deze studie ontdekten we dat ZER melanogenese onderdrukt op melanogene stimuli, -MSH en SCF, in muis B16F10 en menselijke G361 melanoomcellen (Figuur 1).

We maten dus veranderingen in de expressieniveaus van melanogenese-gerelateerde genen en eiwitten na SCF-stimulatie in G361 menselijke melanoomcellen. We ontdekten dat ZER door SCF geïnduceerde MITF- en tyrosinase-eiwitexpressie verzwakt, respectievelijk 2-4 uur en 24-48 uur na SCF-stimulatie (Figuur 2A). Bovendien werd genexpressie van melanogenese-gerelateerde genen, zoals MITF, tyrosinase en tyrosinase-gerelateerd eiwit 1 (TYRP1) onderdrukt in met ZER behandelde G361-cellen (Figuur 2B, C). Deze resultaten onthulden de piektijd voor de expressie van melanogenese-gerelateerde genen na SCF-stimulatie; maximale MITF-mRNA-inductie werd waargenomen binnen 1-2 uur, en mRNA-niveaus van tyrosinase en TYRP1 bereikten hun maximum 24-48 uur na SCF-stimulatie.

2.3. Zerumbone onderdrukt de expressie van melanogene genen en enzymen in B16F10-cellen van muizen

Om het moleculaire mechanisme te onderzoeken waarmee ZER melanogenese onderdrukt, hebben we de genexpressie gemeten van de melanogenese-transcriptiefactor, MITF, en zijn doelgenen, zoals tyrosinase-gerelateerd eiwit 1 (TYRP1), tyrosinase en tyrosinase-gerelateerd eiwit 2 (TYRP2). bij afwezigheid of aanwezigheid van ZER. Aangezien de piektijd voor melanogenese-gerelateerde genexpressie na SCF- en -MSH-stimulatie bekend is voor respectievelijk menselijke G361 (Figuur 2) en B16F10-melanoomcellen van muizen [4], hebben we de expressie van MITF, tyrosinase, TYRP1 en TYRP2 verder gemeten. in met ZER behandelde B16F10-melanoomcellen van muizen na 2 uur of 48 uur incubatie met -MSH. Figuur 3A laat zien dat ZER voldoende is om -MSH-geïnduceerde MITF-, TYRP1-, TYRP2- en tyrosinase-expressie in B16F10-cellen te verzwakken. Evenzo waren MITF-, tyrosinase- en TYRP2-eiwitexpressieniveaus verlaagd na ZER-behandeling. Proteïnekinase A (PKA)-gemedieerde fosforylering van CREB is een belangrijke signaalroute die MITF verhoogt op transcriptioneel niveau na -MSH-stimulatie [4]. Daarom hebben we hier geanalyseerd of verminderde fosforylering van CREB door ZER de onderdrukking van MITF zou kunnen mediëren. We ontdekten dat -MSH-geïnduceerde CREB-fosforylering niet werd beïnvloed door ZER-behandeling, wat suggereert dat ZER -MSH-geïnduceerde MITF-expressie onderdrukt onafhankelijk van de PKA-CREB-signaalroute-as (Figuur 3B). Omdat tyrosinase een snelheidsbeperkend enzym is dat de melaninesynthese reguleert [2,4,11], hebben we de intracellulaire tyrosinase-eiwitniveaus en de enzymatische activiteit ervan na behandeling met arbutine, kojiczuur en ZER verder geanalyseerd. Figuur 3C laat zien dat ZER voldoende door -MSH geïnduceerde tyrosinase-eiwitniveaus in B16F10-cellen verlaagt. Bovendien onthult figuur 3D dat 10 μM ZER L-DOPA-oxidatie effectiever onderdrukt dan tyrosinaseremmers, arbutine en kojiczuur, wat suggereert dat de oxidatie van L-DOPA tot dopaquinon door de enzymatische activiteit van tyrosinase wordt onderdrukt in met ZER behandelde cellen. . Deze resultaten tonen aan dat ZER -MSH-gemedieerde melanogenese verzwakt door genexpressie van MITF, een melanogenese-geassocieerde transcriptiefactor, en zijn doelgenen te onderdrukken.

2.4. Het anti-melanogene effect van Zerumbone is door fosforylering van ERK1/2

Het is bekend dat activering van proteïnekinase B (AKT) en extracellulaire signaalgereguleerde kinasen (ERK1/2) door groeifactoren of melanogene stimuli de melanogenese onderdrukt door de verminderde expressie van MITF en zijn doelgenen [11]. Fosforylering van MITF op Ser73 en Ser409 als reactie op de ERK1/2-signaleringsroute bevordert de proteasoomafhankelijke degradatie ervan [17,18]. Daarom hebben we onderzocht of ZER ERK1 / 2-fosforylering reguleert in B16F10 muizen- en G361 menselijke melanoomcellen. Verhoogde fosforylering van ERK1/2 (p-ERK1/2) maar niet totaal ERK1/2 (T-ERK1/2) werd waargenomen bij ZER-behandeling op een tijd- en dosisafhankelijke manier (Figuur 4A, B). Interessant is dat werd waargenomen dat de fosforylering van ERK1 / 2 snel werd verhoogd binnen 10-30 minuten en 1-2 uur na ZER-behandeling in muis B16F10 en menselijke G361-melanoomcellen (Figuur 4A). De fosforylering van AKT en MEK werd echter niet waargenomen bij ZER-behandeling, wat suggereert dat door ZER geïnduceerde ERK1/2-fosforylering MITF kan onderdrukken (Figuur 4B). Omdat ERK1/2-fosforylering de fosforylering en proteasomale afbraak van MITF bevordert [17,18], hebben we onderzocht of proteasoomremmer de reductie van MITF door ZER voorkomt. Onderdrukking van MITF door ZER werd niet waargenomen in aanwezigheid van MG132, wat bevestigt dat ZER MITF-expressie verlaagt door proteasomale afbraak (Figuur 4C). Vervolgens hebben we onderzocht of ZER MITF fosforyleert op Ser73, het doelresidu van ERK1/2. Om gefosforyleerde MITF te detecteren, werden cellen blootgesteld aan -MSH en MG132. Hier ontdekten we dat gefosforyleerde MITF (Ser73) significant was verhoogd door ZER in aanwezigheid van -MSH en MG132 (Figuur 4D). U0126, een selectieve mitogeen-geactiveerde proteïnekinase (MAPK)-remmer [19], schafte ZER-geïnduceerde MITF-fosforylering af (Figuur 4D). Bovendien werden de totale MITF-eiwitniveaus in lysaten van hele cellen (WCL) niet veranderd door ZER en U0126 in aanwezigheid van MG132 (Figuur 4D). Deze resultaten geven aan dat ERK1/2-gemedieerde MITF (Ser73)-fosforylering en proteasomale afbraak een cruciaal mechanisme is in de door ZER gemedieerde onderdrukking van MITF. Bovendien laat figuur 4E zien dat U0126 verlaagde MITF-eiwitniveaus in met ZER behandelde cellen significant herstelde. Consequent werd het verlaagde intracellulaire melaninegehalte door ZER hersteld met U0126 tot ongeveer 40 procent (Figuur 4F), wat suggereert dat de activering van ERK1/2 vereist is voor het anti-melanogene effect van ZER.

2.5. Antimelanogeen effect van extracten van Zingiber Officinale (ZO).

ZER is een fytochemische stof die is afgeleid van verschillende plantensoorten van de Zingiberaceae-familie, zoals Zingiber zerumbet en Zingiber officinal [12]. Zo hebben we aanvankelijk de levensvatbaarheid van de cellen gemeten in de afwezigheid of aanwezigheid van ZO-extract in B16F10- en HaCaT-cellen. Figuur 5A laat zien dat de levensvatbaarheid van de cellen niet werd veranderd door de behandeling met ZO-extract. We analyseerden verder de anti-melanogene effecten van Zingiber officinal (ZO) -extract. Omdat de expressie van MITF en zijn doel-melanogene genen door ZER werden verlaagd via de geactiveerde ERK1/2-signaleringsroute (figuren 2 en 3), hebben we gecontroleerd of ZO-extract -MSH-geïnduceerde MITF en zijn doel-melanogene eiwitexpressie in B16F10-cellen onderdrukt. Vergelijkbaar met het anti-melanogene effect van ZER, werden -MSH-geïnduceerde MITF, tyrosinase en TYRP2 significant verminderd door het ZO-extract op een dosisafhankelijke manier (Figuur 5B). Interessant genoeg was ERK1/2-fosforylering ook verhoogd in met ZO-extract behandelde cellen (Figuur 5B). Expressie van MITF en zijn doelgenen, zoals tyrosinase, TYRP1 en TYRP2, was significant verminderd na behandeling met 5 μg/μL ZO-extract (Figuur 5C). Bovendien was zowel het extracellulaire als het intracellulaire melaninegehalte aanzienlijk verminderd tot ongeveer 40 procent na behandeling met 5 μg/μL ZO-extract (Figuur 5D). Bovendien werd verminderde tyrosinase-activiteit waargenomen in cellen die werden behandeld met ZO-extract (Figuur 5E). Deze resultaten suggereren dat Zingiber officinal (ZO) -extract melanogenese onderdrukt door MITF-gemedieerde melanogene genexpressie te verzwakken.

Voor meer informatie: david.deng@wecistanche.com WhatApp:86 13632399501