Zika-virus Niet-structureel eiwit 4B werkt samen met DHCR7 om virale infectie te vergemakkelijken

ABSTRACT

Het Zika-virus (ZIKV) ontwikkelt niet-structurele eiwitten om de immuunrespons te omzeilen en een efficiënte replicatie in de gastheercellen te garanderen. Onlangs is gemeld dat het metabolische enzym 7-dehydrocholesterolreductase (DHCR7) van cholesterol invloed heeft op de aangeboren immuunrespons bij een ZIKV-infectie. Het vitale niet-structurele eiwit en de mechanismen die betrokken zijn bij DHCR7-gemedieerde virale ontduiking zijn echter niet goed opgehelderd. In deze studie hebben we aangetoond dat ZIKV-infectie de expressie van DHCR7 mogelijk maakte. Met name het opgereguleerde DHCR7 vergemakkelijkte op zijn beurt de ZIKV-infectie, en het blokkeren van DHCR7 onderdrukte de ZIKV-infectie. Mechanisch interageerde het niet-structurele eiwit 4B (NS4B) van ZIKV met DHCR7 om DHCR7-expressie te induceren. Bovendien remde DHCR7 de fosforylering van TANK-bindend kinase 1 (TBK1) en interferon-regulerende factor 3 (IRF3), wat resulteerde in de vermindering van de productie van interferon-bèta (IFN-) en interferon-gestimuleerde genen (ISG's). Daarom stellen we voor dat ZIKV NS4B zich bindt aan DHCR7 om de activering van TBK1 en IRF3 te onderdrukken, wat op zijn beurt IFN- en ISG's remt, waardoor ZIKV-ontduiking wordt vergemakkelijkt. Deze studie verbreedt de inzichten in hoe virale niet-structurele eiwitten de aangeboren immuniteit antagoneren om virale infectie te vergemakkelijken via cholesterolmetabolische enzymen en tussenproducten.

cistanche tubulosa-verbetering van het immuunsysteem

1. Inleiding

Als een door muggen overgebracht flavivirus werd het Zika-virus (ZIKV) aanvankelijk in 1947 geïdentificeerd bij resusaapjes in Oeganda. De ZIKV-epidemie onderging verschillende uitbraken wereldwijd en is een cumulatieve mondiale bedreiging voor de gezondheid geworden als gevolg van de explosieve uitbreiding via muggenroutes, het wereldwijde reizen van asymptomatische transporters en seksuele overdracht. De meeste ZIKV-infecties tijdens de afgelopen epidemieën waren asymptomatisch of mild (Wang et al., 2016), maar tijdens de laatste paar epidemieën heeft de ZIKV-infectie geleid tot verwoestende ziekten, waaronder neurologische gevolgen tijdens de zwangerschap (microcefalie en foetale sterfte) en neurologische aandoeningen. (Guillain-Barre-syndroom) bij volwassenen (Cao-Lormeau et al., 2016; Pierson en Diamond, 2020; Rasmussen et al., 2016). Het aangeboren immuunsysteem is de eerste en kritische lijn van de immuunafweer van de gastheer tegen virale infecties. Na ZIKV-infectie werd viraal RNA herkend door intracellulair retinoïnezuur-induceerbaar gen I (RIG-I) (Chazal et al., 2018; Hertzog et al., 2018; Kato et al., 2006), wat het stroomafwaartse aangeboren immuunsysteem in gang zette. reacties, waaronder de activering van TANK-bindend kinase 1 (TBK1), de fosforylering van interferon-regulerende factor 3 (IRF3), wat vervolgens leidt tot de productie van type I interferonen (IFN-I) (Fitzgerald et al., 2003; Grant et al., 2016; Xia et al., 2018) en de expressie van tientallen door interferon gestimuleerde genen (ISG's) met verschillende antivirale effecten (Savidis et al., 2016; Schneider et al., 2014). Het immuunsysteem van de gastheer produceert IFN's en ISG's om virale infecties te beperken, maar ZIKV heeft zelf een verscheidenheid aan ontsnappingsmechanismen ontwikkeld om succesvolle overleving en replicatie in de gastheercel te garanderen, zoals het coderen van specifieke niet-structurele (NS) eiwitten. ZIKV-genomisch RNA genereert zeven niet-structurele eiwitten, waaronder NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B en NS5 (Berthoux, 2020). ZIKV NS1 recruteert gastheerdeubiquitinase USP8 om caspase te stabiliseren-1 en verzwakt type I IFN-signalering ten behoeve van ZIKV-infectie (Zheng et al., 2018). Er is gerapporteerd dat een mutant NS1 aan TBK1 bindt en de fosforylatie van TBK1 vermindert, wat leidt tot verminderde IFN-productie (Xia et al., 2018). ZIKV NS3 bindt aan menselijke scaffold-eiwitten (14-3-3ε en 14-3-3η) en sekwestreert deze (Riedl et al., 2019), terwijl NS4A interageert met MAVS om RIG-I- en MDA te verzwakken{{50} }gemedieerde aangeboren immuunreacties (Ma et al., 2018). Met name bindt en degradeert ZIKV NS5 signaaltransducer en activator van transcriptie 2 (STAT2) om type I IFN-signalering te verzwakken (Grant et al., 2016; Kumar et al., 2016). Bovendien is ook bewezen dat NS5 interageert met RIG-I en de K63-gekoppelde polyubiquitinatie van RIG-I onderdrukt, waardoor de IFN-productie wordt onderdrukt (Li et al., 2020). Bovendien is ook aangetoond dat ZIKV NS2A, NS2B, NS4A en NS4B de IFN-productie overmeesteren door zich te richten op afzonderlijke elementen in het RIG-I-pad (Xia et al., 2018). Om efficiënte replicatie in zoogdiercellen te bereiken, vertrouwt de ZIKV ook op de cellulaire lipidenmetabolische componenten van de gastheer om een ​​envelop te vormen en de assemblage van virale deeltjes te voltooien (Chen et al., 2020; Leier et al., 2020). Cholesterol is een van de lipidecomponenten van celmembranen en neemt deel aan meerdere biologische functies (Ikonen, 2008). Cellulaire cholesterolhomeostase wordt nauw gemoduleerd door cholesterolsynthese, inclusief de absorptie door lipoproteïnedeeltjes en afgifte aan extracellulaire acceptoren. Vrijwel alle zoogdiercellen zijn afhankelijk van het cholesterolmetabolisme (Luo et al., 2020). Steeds meer bewijs heeft aangetoond dat het cholesterolmetabolisme deelneemt aan de aangeboren immuunrespons tegen virale infecties (Blanc et al., 2013; Petersen et al., 2014; York et al., 2015). Na virale infectie was de cholesterolsynthese aanzienlijk veranderd en ging gepaard met de verbeterde expressie van IFN-I en ISG's in macrofagen (Li et al., 2017; Liu et al., 2008; York et al., 2015). Als sleutelenzym in het cholesterolmetabolisme zet cholesterol-25-hydroxylase (CH25H) cholesterol om in 25-hydroxycholesterol (25HC), dat is geïdentificeerd als het biologische product dat bijdraagt ​​aan een aangeboren immuunrespons tegen een grote meerderheid van virussen, waaronder het humaan immunodeficiëntievirus 1 (HIV-1), vesiculair stomatitisvirus (VSV), herpes simplex-virus 1 (HSV-1), Ebola-virus (EBOV), ZIKV, muizen-gamma-herpesvirus ( MHV68), Riftdalkoortsvirus (RVFV) en Russisch lente-zomerencefalitisvirus (RSSEV) (Blanc et al., 2013; Li et al., 2017; Liu et al., 2013). De huidige onderzoeken zijn beperkt in het onderzoeken hoe cholesterolmetabolische producten (bijv. 25HC) de signaaltransductie kunnen manipuleren en kunnen bijdragen aan de aangeboren immuniteit. Tot op heden zijn de enzymen of tussenproducten stroomopwaarts van de biosynthese van cholesterol nog steeds niet goed opgehelderd. Als het essentiële cholesterolmetabolische enzym zou 7-dehydrocholesterolreductase (DHCR7) de dubbele C (7–8)-binding in de B-ring van sterolen kunnen uitwissen en de cholesterol uit 7-dehydrocholesterol ({{100} }DHC) (Luu et al., 2015). 7-DHC is ook een voorloper van vitamine D, en DHCR7-mutaties zijn gekoppeld aan hogere vitamine D, wat erop wijst dat DHCR7 gecompliceerde biologische effecten vertoont bij de omzetting van cholesterol en vitamine D (Kuan et al., 2013; Prabhu et al. , 2016a). Een goed gepresenteerde studie heeft aangetoond dat de stilte van DHCR7 de PI3K-AKT3-route zou kunnen activeren, wat zou kunnen leiden tot IRF3 Ser385-fosforylering en de IFN-productie zou kunnen bevorderen om meerdere virale infecties in vitro en in vivo te remmen (Xiao et al., 2020). Het begrip van het door DHCR7-gemedieerde cholesterolmetabolisme bij door ZIKV NS-eiwit gemedieerde immuunontduiking is echter slecht gedefinieerd. Hier verduidelijken we een duidelijk mechanisme dat ZIKV NS4B richt op DHCR7, een sleutelenzym in de cholesterolsynthese, om de IFN-I-respons te verzwakken en ZIKV-infectie te vergemakkelijken. We ontdekten dat een ZIKV-infectie de DHCR7-expressie verhoogde. Interessant is dat versterkt DHCR7 de ZIKV-infectie bevordert, terwijl het uitschakelen of richten van DHCR7 met remmers de ZIKV-infectie kan onderdrukken. Bovendien zou ZIKV NS4B DHCR7 kunnen binden en zo DHCR7-expressie kunnen induceren, wat de activering van TBK1 en IRF3 remde en leidde tot verminderde IFN- en ISG-productie. Daarom stellen we voor dat ZIKV NS4B-binding aan DHCR7 de IRF3-activering vermindert, wat op zijn beurt IFN- en ISG's remt om ZIKV-ontduiking te vergemakkelijken. Deze studie verruimt nieuwe inzichten over hoe het niet-structurele ZIKV-eiwit de aangeboren immuniteit afschaft om virale infectie te vergemakkelijken door interactie met cholesterolmetabolische enzymen.

cistanche tubulosa-verbetering van het immuunsysteem

Klik hier om de producten van Cistanche Enhance Immunity te bekijken

【Vraag om meer】 E-mail:cindy.xue@wecistanche.com / Whats-app: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

2. materialen en methoden

2.1. Cel lijnen

U251-cellen werden gekocht bij het China Center for Type Culture Collection (CCTCC) (Wuhan, China). Cercopithecus aethiops niercellen (Vero), menselijke embryonale niercellen (HEK 293T) en menselijke longadenocarcinoomcellen (A549) werden gekocht bij de American Tissue Culture Collection (ATCC). De cellen werden bewaard in Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) (Gibco) aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS) (Gibco), penicilline (100 U/ml) en streptomycinesulfaat (100 ug/ml) bij 37°C en 5°C. % CO2. Aedes albopictus (C6/36)-cellen werden gekweekt in Minimum Essential Medium (MEM) aangevuld met 10% FBS, penicilline (100 U/ml) en streptomycinesulfaat (100 ug/ml) bij 28 C met 5% CO2.

2.2. ZIKV-amplificatie, titratie en infectie

Het ZIKV-isolaat z16006 (GenBank-inschrijvingsnummer, KU955589.1) werd gekweekt in C6/36-cellen, en ZIKV werd in hoeveelheden in vriesflesjes verdeeld en bij 80°C bewaard. ZIKV-titers werden gemeten door middel van plaque-assay. De cellen werden gedurende 2 uur geïnfecteerd met ZIKV bij de aangegeven multipliciteit van infectie (MOI), gevolgd door wassen met fosfaatbufferzoutoplossing (PBS), en vervolgens gekweekt, geoogst en onderzocht.

2.3. Plasmiden en reagentia

Expressieplasmide pcDNA3.1(þ)-3 Flag werd gebruikt om individuele ZIKV-genen te klonen uit overeenkomstige fragmenten van ZIKV-cDNA. Om pGEX6p-1-NS4B te construeren, werd de ZIKV NS4B gesubkloneerd in pGEX6p-1-vector met behulp van ClonExpress II One Step Cloning Kit (Vazyme Biotech, Nanjing, China). De cDNA's die coderen voor menselijk DHCR7, RIG-I, TBK1 en IRF3, gekloond in pCAGGS-HA-vector of pcDNA3.1 (þ)-3 Flag-vector, werden geconstrueerd met behulp van de standaard moleculaire kloonmethode. De missense mutatie G410S van DHCR7 werd geconstrueerd met behulp van plaatsgerichte mutagenesemethode. Monoklonale anti-ZIKV-envelop van konijn (GTX133314) werd gekocht bij GeneTex (Irvine, CA, VS). Polyklonaal konijn anti-DHCR7 (A8049), monoklonaal konijn anti-ISG15 (A2416), monoklonaal konijn anti-TBK1 (A3458), monoklonaal konijn anti-P-TBK1 op Ser172 (AP1026), polyklonaal konijn anti-IRF3 (A11118), anti -konijn IgG (ac005) en anti-muis IgG (ac011) werden gekocht bij ABclonal Technology (Wuhan, China). Antimuis FITC en anti-konijn Cy3 secundaire antilichamen werden gekocht bij Abbkine (Wuhan, China). Monoklonaal anti-P-IRF3 van konijn op Ser396 (29047S) en monoklonaal anti-ISG56 van konijn (14769S) werden gekocht bij Cell Signaling Technology (CST, Boston, MA, VS). Monoklonaal anti-Flag van muis (F3165), monoklonaal anti-HA van konijn (H6908) en monoklonaal anti-GAPDH van muis (G9295) werden gekocht bij Sigma (St. Louis, MO, VS). Monoklonaal anti-Flavivirusgroep-antigeen-antilichaam van muizen (MAB10216) werd gekocht bij Millipore (Mass, VS). Lipofectamine 2000 (11668-027) en Trizol (15596018) werden gekocht bij Invitrogen Corporation (Carlsbad, CA, VS). Poly (I: C) werd gekocht bij InvivoGen (San Diego, CA, VS).

2.4. Plaquetest

Het ZIKV-bevattende supernatant werd gedurende 2 uur verdund met serumvrij DMEM en geïnfecteerde Vero-cellen in een plaat met 12-putjes, gevolgd door tweemaal wassen met 1 ml PBS. DMEM dat 2% FBS en 2% agarose met laag smeltpunt bevatte, werd goed gemengd volgens een volumeverhouding van 1:1, en 1 ml mengsel werd aan elk putje toegevoegd. De geïnfecteerde cellen werden gedurende 5-7 dagen bij 37 C met 5% CO2 gekweekt. De cellen werden gedurende 1 uur gefixeerd met 4% paraformaldehyde en gedurende 30 minuten gekleurd met 0,5% kristalviolet. De 12-putjesplaat werd gewassen met water en de plaques werden berekend.

2.5. Productie en infectie van lentivirus

De targetingsequenties van shRNA's voor de menselijke DHCR7 waren als volgt: sh-DHCR7-1: 50 -ATTGCCAGCACAGACGGATTT-30, sh-DHCR7-2: 50 -CGTGATTGACTTCTTCTGGAA{ {8}}. De pLKO.1-vector met een gecodeerd shRNA voor een negatieve controle (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, VS) of de specifieke doelsequentie werd samen met psPAX2 en pMD2.G met Lipofectamine 2 getransfecteerd in HEK293T-cellen.{{19} }00. Virale deeltjes die supernatanten bevatten, werden 36 uur na transfectie geoogst en vervolgens 10 minuten bij 210 g gecentrifugeerd. De celvrije supernatantfase werd gefiltreerd door een filter van 0,45 μm om het celafval te verwijderen. U251-cellen werden geïnfecteerd met lentivirale deeltjes in aanwezigheid van 8 ug/ml polybreen. Na 48 uur kweken werden U251-cellen geselecteerd met puromycine (2 ug/ml, Sigma). De knock-down-efficiëntie van sh-DHCR7 werd bepaald door RT-PCR en Western blot-analyse.

cistanche tubulosa-verbetering van het immuunsysteem

2.6. Westerse vlek

Cellen werden gelyseerd door RIPA-buffer aangevuld met proteaseremmers en fosfataseremmers op ijs gedurende 1 uur, vervolgens gecentrifugeerd bij 4 C, 13,000 g gedurende 1{{10}} min om de cel te verzamelen. lysaat. De eiwitconcentratie in cellysaat werd gemeten met behulp van bicinchoninezuur (BCA) eiwittest. Het eiwit werd gescheiden door SDS-PAGE en vervolgens overgebracht op een polyvinyldifluoride (PVDF) membraan. Het PVDF-membraan werd gedurende 1 uur geblokkeerd met immunoblotting-blokkeerbuffer TBST (10 mmol/l Tris-HCl, pH 7,4, 0,15 mol/l NaCl en 0,05% Tween-20) die 5% BSA bevatte. Na wassen met TBST werd het membraan geïncubeerd met primaire antilichamen en tweede antilichamen en vervolgens gedetecteerd met behulp van een Chemiluminescentie-beeldvormingssysteem (Bio-Rad).

2.7. Totaal cholesterolonderzoek

Het totale cholesterol in cellen werd gedetecteerd met behulp van een Tissue totaal cholesterol testkit van Applygen Technologies Inc. (Beijing, China). De 5 mmol/L-cholesterolstandaard werd onderworpen aan een seriële verdunning met watervrije ethanol om de standaardcurve te tekenen, en de hoeveelheden cellulair totaal cholesterol werden berekend volgens de standaardcurven. Het experiment werd uitgevoerd volgens de procedure van de fabrikant.

2.8. Co-immunoprecipitatietesten

HEK293T-cellen werden getransfecteerd met de aangegeven plasmiden. Cellen werden geoogst en gelyseerd met RIPA-lysebuffer aangevuld met proteaseremmers. Na centrifugatie bij 18,000 g gedurende 15 minuten bij 4 ° C werden cellysaten verzameld en gedurende 4 uur bij 4 ° C immunoprecipiteerd door Flag-Trap ProteinG Sepharose (GE Healthcare, Milwaukee, WI, VS). werden geëlueerd met 2 laadbuffer en geanalyseerd door middel van immunoblotting.

2.9. Real-time PCR

Totale RNA's werden uit cellen geëxtraheerd met behulp van TRIzol-reagens (Invitrogen Life Technologies) en cDNA werd geproduceerd met een M-MLV reverse transcriptase-kit (Promega, Madison, WI, VS). RT-PCR werd uitgevoerd met behulp van SYBR RT-PCR Kits (DBI Bio-science) op de Roche LC480. Glyceraldehyde-3-fosfaatdehydrogenase (GAPDH)-mRNA werd ingesteld als de endogene referentie om de mRNA's te normaliseren en de genexpressieniveaus werden berekend met behulp van de 2 ΔΔCT-methode. De sequenties van RT-PCR-primers worden getoond in aanvullende tabel S1. 2.10. Confocale microscopie

U251-cellen werden getransfecteerd met plasmide en gedurende 30 uur gekweekt, daarna driemaal gewassen met PBS. Cellen werden gedurende 15 minuten gefixeerd met 4% paraformaldehyde en gedurende 5 minuten gepermeëerd met PBS dat 0,1% TritonX-100 bevatte. Na wassen met PBS werden de cellen gedurende 30 minuten afgesloten met PBS dat 5% BSA bevatte. Cellen werden driemaal gewassen met PBS en geïncubeerd met anti-HA, anti-FLAG en anti-flavivirus, en vervolgens geïncubeerd met anti-muis FITC en anti-konijn Cy3 secundaire antilichamen. Cellen werden gekleurd met 40,6-Diamidino-2-fenylindooldihydrochloride (DAPI) en uitgevoerd met behulp van een confocale microscoop van Olympus.

2.11. GST pull-down-testen

Het plasmide pGEX6p-1-NS4B werd getransfecteerd in Escherichia coli (E. coli) stam BL21. De GST en GST-NS4B werden geïnduceerd door IPTG met een eindconcentratie van 0.5 mmol/L, en de kweken werden nog eens 6-8 uur bij 37 C gekweekt. En vervolgens werden het GST-eiwit en GST- NS4B-eiwit werd gezuiverd uit E. coli-bacteriën. Het GST- of GST-NS4B-eiwit werd geïncubeerd met glutathion-Sepharose-kralen (Novagen) en driemaal gewassen met PBS. GST- en GST-NS4B-eiwit werden gedurende 4 uur bij 4 ° C geïncubeerd met het eukaryotische fusie-eiwit HA-DHCR7, dat afkomstig was van plasmiden die coderen voor HA-DHCR7-tot expressie gebrachte HEK293T-cellysaten. De neerslagen werden vijf keer gewassen en ingekookt in 2 SDS-laadbuffer, en gedetecteerd met Western-blot met anti-GST- en anti-HA-antilichamen.

2.12. HA-DHCR7 plaatsgerichte mutagenese

Geschikte paren mutagene primers (aanvullende tabel S1) werden gesynthetiseerd en gebruikt om het gemuteerde construct door PCR te genereren. HA-DHCR7 werd gebruikt als sjabloon voor PrimeSTAR® HS Premix (Takara). Na PCR werd het wildtype plasmide dat in het PCR-product achterbleef selectief gedigereerd door DpnI (New England Biolabs). Het gedigereerde PCR-product werd getransfecteerd in E. coli-stam DH5. De gewenste mutant werd bevestigd door middel van Sanger-sequentieanalyse.

cistanche plantverhogend immuunsysteem

2.13. statistische analyse

Alle experimenten werden minstens drie keer herhaald met vergelijkbare resultaten. Gegevens worden uitgedrukt als gemiddelde standaardafwijking (SD). De significantie van de variabiliteit werd bepaald door de tweezijdige ongepaarde t-test van de student voor twee-groeps- of eenwegs-ANOVA met de meervoudige vergelijkingstest van Dunnett of tweewegs-ANOVA met de meervoudige vergelijkingstest van Sidak voor vergelijkingen van meerdere groepen met behulp van de GraphPad Prism-software. (versie 8.0.1). Een waarde van P < 0.{{10}}5 werd als statistisch significant beschouwd, en P > 0.05 werd als statistisch niet-significant geïdentificeerd. Voor alle gegevens werd de significantie weergegeven als *P < 0,05, **P < 0,01 en ***P < 0,001.

3. Resultaten

3.1. ZIKV-infectie induceert DHCR7-expressie

Steeds meer bewijs heeft aangetoond dat het cholesterolmetabolisme de aangeboren immuunreacties van de gastheer tegen flavivirusinfecties, zoals het ZIKV- en het Dengue-virus (DENV) beïnvloedt (Leier et al., 2020; Randall, 2018). DHCR7 codeert voor een enzym dat 7-DHC omzet in cholesterol, de laatste stap in de biosynthese van cholesterol (Moebius et al., 1998). We ontdekten voor het eerst DHCR7-expressie na ZIKV-infectie. Menselijke astrocyt U251 was geïnfecteerd met ZIKV, dat de DHCR7-expressie op zowel mRNA als eiwit dosisafhankelijk verhoogde (Fig. 1A – C). Om het fenomeen te bevestigen, onderzochten we vervolgens de DHCR7-expressie in Vero-cellen en ontdekten dat ZIKV-infectie substantieel DHCR7-expressie induceerde (Fig. 1D-F), wat consistent was met de resultaten in U251-cellen.

cistanche voordelen-versterken het immuunsysteem

3.2. Het richten op DHCR7 lokt een kritische anti-ZIKV-activiteit uit

Om de effecten van DHCR7 tegen ZIKV-infectie te evalueren, werden de U251- en A549-cellen getransfecteerd met voor HA-DHCR7 coderend plasmide en vervolgens geïnfecteerd met ZIKV (MOI=1). De resultaten toonden aan dat overexpressie van DHCR7 de ZIKV-mRNA-expressie significant verhoogde (Fig. 2A en B). Met name met de accumulatie van DHCR7-eiwit was de expressie van structureel ZIKV-eiwit E ook verhoogd (Fig. 2C en D). Daarnaast voerden we verder een plaquetest uit met behulp van de supernatant uit figuur 2C en ontdekten dat overexpressie van DHCR7 de plaquevormende eenheden aanzienlijk verhoogde, vergeleken met de controlegroep (figuur 2E en F). Er is gerapporteerd dat de missense mutatie G410S van DHCR7 de enzymactiviteit afschaft (Fitzky et al., 1998; Shim et al., 2004; Witsch-Baumgartner et al., 2000). Om de effecten van DHCR7 op ZIKV-infectie verder te bepalen, hebben we vervolgens een inactieve mutant van DHCR7 (G410S) geconstrueerd. Vergeleken met het wildtype DHCR7 zou de G410S-mutant de ZIKV-infectie aanzienlijk kunnen remmen (Fig. 2G). We hebben ook een confocale microscopietest uitgevoerd om de waarneming te bevestigen. Zoals getoond in Fig. 2H verhoogde overexpressie van DHCR7 de ZIKV-infectie. Om te bepalen of endogene DHCR7-enzymactiviteit cruciaal is voor ZIKV-infectie, hebben we twee korte haarspeld-RNA's (shDHCR7-1 en sh-DHCR7-2) ontworpen die specifiek gericht zijn op DHCR7 en genereerde DHCR7-gedempte U251-cellen lijnen met shRNA-systeem (Fig. 3A). Ten slotte hebben we een sh-DHCR7-1 geselecteerd vanwege zijn hogere dempingsefficiëntie. Vergeleken met door cellijnen getransduceerde controle-shRNA vertoonden deze DHCR7-knockdown-cellen een lagere gevoeligheid voor ZIKV-infectie (Fig. 3B en C). Vervolgens gebruikten we de selectieve DHCR7-remmer AY9944, die voorkomt dat 7-DHC overgaat in cholesterol (Xu et al., 2011), waarvan is aangetoond dat deze de enzymatische activiteit van DHCR7 remt (Horlick, 1966; Moebius et al., 1998). Vergeleken met de controle remde toediening van AY9944 dosisafhankelijk de ZIKV-infectie in U251-cellen (Fig. 3D-F). Er werd ook een plaquetest uitgevoerd in Vero-cellen om de effecten van DHCR7 verder te beoordelen, en om aan te tonen dat AY9944 de ZIKV-infectie aanzienlijk kon onderdrukken (Fig. 3G en H). Met name toonde confocale microscopie aan dat het ZIKV E-eiwit substantieel werd verminderd in de aanwezigheid van AY9944 (Fig. 3I). Deze bevindingen gaven aan dat het richten op DHCR7 de ZIKV-infectie zou kunnen remmen.

Fig. 1. ZIKV-infectie induceert DHCR7-expressie. A – F U251- en Vero-cellen werden gedurende 24 uur geïnfecteerd met ZIKV (MOI ¼ 0, 1 en 2) en de intracellulaire RNA-niveaus van ZIKV (A, D) en DHCR7 (B, E) werden bepaald door RT-PCR met GAPDH als interne controle. De relatieve eiwitniveaus van DHCR7- en ZIKV-enveloppen werden gedetecteerd met Western-blot (C, F). Gegevens zijn afkomstig van ten minste drie onafhankelijke experimenten (gemiddelde SD) of representatieve gegevens (C, F). De statistische significantie werd berekend met behulp van eenwegs-ANOVA met de meervoudige vergelijkingstest van Dunnett (A, B, D, E). **P < 0.01, ***P < 0,001. SD, standaarddeviatie.

3.3. DHCR7 remt de activering van TBK1 en IRF3 om de productie van IFN- en ISG's te verminderen

Omdat DHCR7 het essentiële enzym is voor het omzetten van 7-DHC in cholesterol (Moebius et al., 1998) en een ZIKV-infectie de DHCR7-expressie zou kunnen verhogen, hebben we daarom het cholesterolniveau na een ZIKV-infectie gemeten. We onthulden dat ZIKV-infectie weinig effect heeft op de cholesterolsynthese in U251- en Vero-cellen (Fig. 4A en B), hoewel DHCR7 verhoogd was (Fig. 1A-D). Gegeven de verhoogde DHCR7 bij ZIKV-infectie en de sleutelrollen van IFN's bij de confrontatie met ZIKV-infectie, bepaalden we vervolgens het effect van DHCR7 op de IFN-I-signaleringsroute. Controle- en DHCR7-uitschakelings-U251-cellen werden geïnfecteerd met ZIKV of getransfecteerd met poly(I:C) en IFN-expressie werd onderzocht. Vergeleken met de controlegroep verhoogde de ZIKV-infectie of poly(I:C)-behandeling de IFN-expressie aanzienlijk in DHCR7-waardoor U251-cellen tot zwijgen werden gebracht (Fig. 4C en D). ISG's zijn de effectoren van interferonacties en spelen een belangrijke rol in de aangeboren immuunafweer tegen ZIKV-infectie. We hebben ook aangetoond dat het blokkeren van DHCR7 de ISG15- en ISG56-expressie op zowel mRNA- als eiwitniveaus aanzienlijk zou kunnen versterken (Fig. 4E-J). Consequent zou behandeling met DHCR7-remmer AY9944 IFN-, ISG15- en ISG56-expressie kunnen induceren (Fig. 4K, L). Belangrijk is dat de inactieve mutant G410S de remmende effecten van DHCR7 op IFN- en ISG-expressie gedeeltelijk zou kunnen omkeren (Fig. 4M, N). TBK1- en IRF3-activering is essentieel voor de inductie van IFNs-ISGs, daarom onderzochten we vervolgens het effect van DHCR7 op de expressie en activering van TBK1 en IRF3. We hebben aangetoond dat DHCR7 niet alleen dosisafhankelijk het eiwitniveau remde, maar ook het niveau van TBK1- en IRF3-fosforylering onderdrukte (Fig. 5A-C). Bovendien heeft de inactieve mutant G410S de remmende effecten van DHCR7 op IRF3- en TBK1-fosforylering onvolledig omgekeerd (Fig. 5D). In overeenstemming met de bevindingen van overexpressie van DHCR7, zou behandeling met AY9944 IRF3- en TBK1-activering in de U251-cel kunnen induceren (Fig. 5E).

3.4. ZIKV NS4B werkt samen met DHCR7 om de fosforylering van TBK1 en IRF3 te remmen

Steeds meer bewijs heeft onthuld dat ZIKV specifieke NS-eiwitten heeft ontwikkeld om efficiënte replicatie in gastheercellen mogelijk te maken door de aangeboren en adaptieve immuniteit van de gastheer direct te omzeilen via een overvloed aan discrete mechanismen. We hebben een co-IP-test uitgevoerd om te screenen op het individuele ZIKV NS-eiwit dat zou kunnen interageren met DHCR7. HEK293T-cellen werden gecotransfecteerd met pCMV-DHCR7-HA en plasmide dat individueel NS-eiwit tot expressie brengt, gefuseerd met Flag-tag. Zoals getoond in Fig. 6A bindt DHCR7 alleen aan NS4B maar slaagt er niet in om te interageren met andere NS-eiwitten. Wederkerige co-IP-testen werden verder uitgevoerd en toonden aan dat NS4B-eiwit een interactie aanging met DHCR7 in HEK293T-cellen (Fig. 6B en C). Om de interactie van NS4B en DHCR7 te bevestigen, voerden we vervolgens een confocale microscoop uit en ontdekten dat NS4B-eiwit en DHCR7-eiwit gecolokaliseerd waren in het cytoplasma (Fig. 6D). GST pull-down assay demonstreerde verder de interactie van NS4B en DHCR7 (Fig. 6E). Bovendien zou voorbijgaande transfectie van NS4B in U251-cellen op dramatische wijze DHCR7-expressie kunnen induceren (Fig. 6F). Belangrijk is dat NS4B op dosisafhankelijke wijze de fosforylering van zowel TBK1 als IRF3 zou kunnen blokkeren, wat positief gecorreleerd was met de verbeterde activering van TBK1 en IRF3 als reactie op DHCR7 (Fig. 6G en H). Overexpressie van NS4B in HEK293T-cellen verlaagde echter het eiwitniveau van TBK1 aanzienlijk, maar had weinig effect op IRF3-eiwit (Fig. 6G en H). Om deze waarnemingen verder te bevestigen, werd NS4B getransfecteerd in DHCR7 knockdown U251-cellen en vertoonde remmende effecten op endogene eiwit- en fosforylatieniveaus van TBK1 en IRF3 (Fig. 6I). Samengevat toonden deze resultaten aan dat ZIKV NS4B interageerde met DHCR7 en de DHCR7-expressie verbeterde om TBK1- en IRF3-activering te blokkeren en vervolgens ZIKV-infectie te vergemakkelijken.

Fig. 2. Overexpressie van DHCR7 bevordert ZIKV-replicatie. AD U251- en A549-cellen werden gedurende 12 uur in de aangegeven concentraties getransfecteerd met HA-vector of HA-DHCR7 en vervolgens nog eens 36 uur geïnfecteerd met ZIKV. De ZIKV-RNA-niveaus werden gedetecteerd door RT-PCR met GAPDH als interne controle (A, B), en de eiwitniveaus van de ZIKV-envelop, HA-DHCR7 en GAPDH werden gedetecteerd door Western-blot (C, D). E, F Vero-cellen werden 48 uur geïnfecteerd met ZIKV-bevattende supernatant uit Fig. 2C om ZIKV-kopieën te bepalen door middel van plaque-assay. GU251-cellen werden 12 uur getransfecteerd met HA-vector, HA-DHCR7 of HA-DHCR7 (G410S) en 36 uur geïnfecteerd met ZIKV, en de eiwitniveaus van ZIKV-envelop, HA-DHCR7 en GAPDH werd gedetecteerd met Western-blot. HU251-cellen werden gedurende 12 uur getransfecteerd met HA-vector of HA-DHCR7 (1 ug), geïnfecteerd met ZIKV gedurende 36 uur, en vervolgens geïncubeerd met anti-flavivirus van muizen en anti-HA-antilichamen van konijnen, gevolgd door kleuring met FITC-geconjugeerde antimuis en anti-HA-antilichamen. Cy3-geconjugeerde secundaire antilichamen tegen konijnen. Kernen werden gekleurd met DAPI. De beelden werden gevisualiseerd door confocale microscopie. Schaalbalk ¼ 100 μm. Gegevens zijn afkomstig van ten minste drie onafhankelijke experimenten (gemiddelde SD) of representatieve gegevens (C, D, E, G, H). De statistische significantie werd berekend met behulp van de tweezijdige ongepaarde t-test van Student (F) of eenrichtings-ANOVA met de meervoudige vergelijkingstest van Dunnett (A, B). *P<0,05, ***P<0,001. SD, standaarddeviatie.

4. Discussie

Type I IFN's en hun stroomafwaartse ISG's worden geconfronteerd met een grote reeks pathogenen en spelen een cruciale rol in de immuunafweer van de gastheer tegen ZIKV (Lazear et al., 2016). Om de door IFN gemedieerde surveillance te omzeilen en voldoende replicatie te bereiken, ontwikkelt ZIKV NS-eiwitten die zich richten op verschillende punten van de IFN-signaalroute om het cellulaire aangeboren immuunsysteem te ontvluchten (Lee et al., 2021). Montagestudies hebben geïllustreerd dat ZIKV NS1, NS3, NS4A en NS5 verschillende modules van de RIG-I/IFN-I-route remmen en virale infectie vergemakkelijken met behulp van onafhankelijke en diverse mechanismen (Grant et al., 2016; Kumar et al., 2016 ; Ma et al., 2018; Riedl et al., 2019; Xia et al., 2018; Zheng et al., 2018). Het specifieke mechanisme van ZIKV NS4B dat immuunrestrictie tegengaat, is echter slecht gedefinieerd. ZIKV NS4B is een extreem hydrofoob eiwit bestaande uit 251 aminozuren en bevindt zich in het endoplasmatisch reticulummembraan met N-terminal (Zou et al., 2014). NS4B-remming van de IFN-I-signaalroute is geïdentificeerd in verschillende flavivirussen (Ding et al., 2013; Munoz-Jordan et al., 2003, 2005; Shan et al., 2021; Yi et al., 2016; Zhang et al. al., 2021). Een recente studie heeft gemeld dat de in Brazilië geïsoleerde ZIKV INMI1-stam NS4B gebruikt om de stroomafwaarts van de IFN-I-signaalroute tegen te werken door STAT1-fosforylering te verpletteren en dientengevolge het STAT1-nucleaire transport te onderbreken (Fanunza et al., 2021). In deze studie hebben we een duidelijk mechanisme gevonden waarbij ZIKV NS4B de IFN-productie afschafte door de fosforylatie van TBK1 en IRF3, de stroomopwaartse component van de IFN-I-signaleringsroute, te onderdrukken. Met name aminozuursubstitutie (G18R) is ontdekt in ZIKV NS4B, wat heeft bijgedragen aan de verminderde IFN-productie en de verzwakte ISG-expressie, en bijgevolg virale infectie bij muizen heeft vergemakkelijkt, wat het belang van NS4B als determinant van pathogenese aangeeft (Gorman et al. ., 2018). Opkomend bewijsmateriaal wees op het cruciale belang van het cholesterolmetabolisme dat deelneemt aan de aangeboren immuunrespons (Akula et al., 2016; Dang et al., 2017; Reboldi et al., 2014; York et al., 2015). Hoewel gedocumenteerd is dat verschillende tussenproducten in het cholesterolmetabolisme brede antivirale effecten hebben (Blanc et al., 2013; Li et al., 2017; Liu et al., 2013; Xiao et al., 2020), illustreerde onze studie een nieuw mechanisme dat cholesterolmetabolisch enzym DHCR7 betrokken was bij ZIKV-infectie door de activering van TBK1 en IRF3 te verzwakken om virale infectie te vergemakkelijken. Als sleutelenzym dat betrokken is bij desmosterol- en cholesterolmetabolisme, vertegenwoordigt DHCR7 een omschakeling van de omzetting van 7-DHC in vitamine D in huidcellen die zijn blootgesteld aan UVB (Prabhu et al., 2016b). Bovendien bevindt DHCR7 zich niet alleen aan de poort van de Bloch-route, maar ook aan het einde van de Kandutsch-Russell-route (Prabhu et al., 2016a, 2016b), die een cruciale rol speelt bij het beheersen van de cholesterolsynthese. De overspraak van DHCR7 en de interactie ervan met andere enzymen in verschillende routes kunnen meerdere functies in verschillende celtypen of organen versterken. Uit eerder onderzoek is gebleken dat het blokkeren van DHCR7 desmosterol, de directe voorloper van de cholesterolbiosynthese, zou kunnen verminderen, waardoor voldoende bescherming wordt geboden tegen HCV-infectie (Luu et al., 2015; Rodgers et al., 2012). Belangrijk is dat Xiao et al. hebben aangetoond dat VSV-infectie de DHCR7-expressie vermindert, wat leidt tot een verlaagd cholesterol, maar tot veel meer 7-DHC-accumulatie in macrofagen en de lever (Xiao et al., 2020). Macrofagen behandeld met 7-DHC zorgden voor een verbeterde antivirale respons; terwijl de toevoeging van cholesterol een geringe bescherming vertoonde. De DHCR7-remmers en de toediening van 7-DHC kunnen nuttige benaderingen zijn om virale infecties zoals HIN1, HSV en VSV te bestrijden. In deze studie ontdekten we dat DHCR7-remmer AY9944 de ZIKV-infectie kon onderdrukken. Uit ons onderzoek bleek echter dat een ZIKV-infectie de DHCR7-expressie induceerde, maar weinig effect had op de cholesterolbiosynthese in gliacellen. We hebben het niveau van 7-DHC-expressie na een ZIKV-infectie niet onderzocht. Niettemin is het de moeite waard om verder te onderzoeken of 7-DHC en AY9944 een synergetische therapeutische werkzaamheid hebben bij de behandeling van patiënten die zijn geïnfecteerd met ZIKV infectie in de hersenen. Overexpressie van DHCR7 bevorderde de ZIKV-infectie, terwijl de behandeling met de DHCR7-selectieve remmer (AY9944) de IFN-productie tegen ZIKV-infectie sterk verhoogde. TBK1- en IRF3-activering is van vitaal belang voor het primen van IFN-I-signalering. Uit eerder onderzoek bleek dat DHCR7-uitschakeling of 7-DHC-behandeling de PI3K-AKT3-route activeerde om IRF3 te fosforyleren, maar niet TBK1 in macrofagen (Xiao et al., 2020). Niettemin toonden onze bevindingen aan dat DHCR7 dosisafhankelijk zowel de IRF3- als TBK1-expressie verlaagde, evenals de IRF3- en TBK1-fosforylering. Deze onderzoeken suggereerden dat DHCR7 zou kunnen bijdragen aan ZIKV-infectie via een cholesterolmetabolisme-onafhankelijk mechanisme in de hersenen. Het is goed opgehelderd dat ZIKV NS-eiwitten gebruikte om rechtstreeks te interageren met verschillende componenten van de RIG-I/IFN-I-route om de immuunrespons te omzeilen en virale replicatie te vergemakkelijken. We rapporteerden eerder de interactie van ZIKV NS5 met RIG-I om de IFN-productie te verminderen (Li et al., 2020). Anderen hebben aangetoond dat ZIKV NS1 en NS2B zich richtten op TBK1, NS3 zich richtte op RIG-I en MDA5 om de productie van IFN-I en ISG's te verminderen (Lee et al., 2021; Riedl et al., 2019). De functie van ZIKV NS-eiwitten die zich richten op het cholesterolmetabolisme blijft echter grotendeels ongrijpbaar. In deze studie hebben we ook een niet-gerapporteerde interactie geïllustreerd tussen het cholesterolmetabolische enzym DHCR7 en ZIKV NS-eiwitten. We toonden aan dat DHCR7 specifiek gebonden was aan NS4B, niet aan andere NS-eiwitten. We leverden het kritische bewijs dat ZIKV NS4B interageerde met DHCR7 en de expressie ervan substantieel induceerde, wat consistent was met de resultaten in U251-cellen na ZIKV-infectie. Belangrijk is dat we, naast het direct aantonen van de betrokkenheid van DHCR7 en ZIKV NS4B, ook ontdekten dat ZIKV NS4B de expressie van DHCR7 verhoogde om de fosforylatie van TBK1 en IRF3 te remmen en ZIKV-infectie te vergemakkelijken. In overeenstemming met onze resultaten onthulde een recente studie dat DHCR7-deficiëntie IRF3- en IFN-signalering zou kunnen activeren om VSV en andere virussen in macrofagen te remmen.

Fig. 3. Neerhalen van DHCR7 vermindert ZIKV-infectie in U251-cellen. U251-cellen werden getransduceerd met de lentivirale deeltjes die shRNA bevatten tegen DHCR7 (shDHCR7-1 en sh-DHCR7-2) of een niet-doelwitsequentie (sh-NTC), gevolgd door puromycineselectie gedurende 14 dagen. De knockdown-efficiëntie werd bepaald met RT-PCR. B, C DHCR7-uitschakeling van U251 (sh-DHCR7) en sh-NTC U251-cellen werden schijngeïnfecteerd of ZIKV-geïnfecteerd (MOI=1) gedurende 36 uur. Het intracellulaire ZIKV-RNA-niveau werd gedetecteerd door RT-PCR met GAPDH als interne controle (B) en de eiwitniveaus van de ZIKV-envelop, DHCR7 en GAPDH werden gedetecteerd door Western blot (C). D, EU251-cellen werden gedurende 2 uur behandeld met DHCR7-remmer AY9944 in de aangegeven concentratie, daarna infectie met ZIKV (MOI=1) gedurende 48 uur. De cellen werden onderworpen aan RT-PCR om ZIKV-RNA te detecteren (D). De eiwitniveaus van de ZIKV-envelop, DHCR7 en GAPDH werden gedetecteerd met Western-blot (E). FU251-cellen werden gedurende 36 uur in de aangegeven concentratie behandeld met DHCR7-remmer AY9944, en DHCR7 en GAPDH werden gedetecteerd met Western-blot. G, H Vero-cellen werden 48 uur geïnfecteerd met ZIKV-bevattende supernatant uit Fig. 3E om ZIKV-kopieën te bepalen door middel van plaque-assay. I U251-cellen werden gedurende 2 uur behandeld met AY9944 in de aangegeven concentratie, daarna infectie met ZIKV bij MOI=1 gedurende 36 uur. De beelden werden gevisualiseerd door confocale microscopie. Schaalbalk ¼ 100 μm. Gegevens zijn afkomstig van ten minste drie onafhankelijke experimenten (gemiddelde SD) of representatieve gegevens (C, E, F, G en I). De statistische significantie wordt berekend met behulp van eenwegs-ANOVA met de meervoudige vergelijkingstest van Dunnett (A, D, H) of tweewegs-ANOVA met de meervoudige vergelijkingstest van Sidak (B). ***P <0,001. SD, standaarddeviatie.

Fig. 4. DHCR7 remt de IFN- en ISG-productie. A-, B U251- en Vero-cellen werden gedurende 24 uur geïnfecteerd met ZIKV (MOI ¼ 0, 0.5 en 1) en het cellulaire cholesterol werd gemeten met een weefsel-totaalcholesteroltestkit. C – H DHCR7-silencing U251 (sh-DHCR7) en sh-NTC U251-cellen werden geïnfecteerd met ZIKV (MOI=1) of behandeld met Poly(I: C) (1 ug/ml) gedurende 6 uur. Totaal cellulair RNA werd geëxtraheerd en onderworpen aan RT-PCR voor de mRNA-expressie met GAPDH als interne controle. De relatieve expressies van IFN- en ISG's werden genormaliseerd naar die van sh-NTC-monsters in de nepgroep, en vouwveranderingen werden buitensporig getoond. IFN- (C, D), ISG15 (E, F) en ISG56 (G, H). I, J DHCR7-silencing U251 (sh-DHCR7) en sh-NTC U251-cellen werden geïnfecteerd met ZIKV (MOI=1) of getransfecteerd met Poly(I: C) (1 ug/ml) gedurende 24 uur, en de eiwitniveaus van ISG15, ISG56 en GAPDH werden gedetecteerd met Western-blot. K U251-cellen werden gedurende 2 uur behandeld met de aangegeven dosis AY9944 en vervolgens gedurende 6 uur geïnfecteerd met ZIKV (MOI=1). Het IFN-RNA-niveau werd gedetecteerd door RT-PCR met GAPDH als interne controle. LU251-cellen werden gedurende 2 uur behandeld met de aangegeven dosis AY9944 en vervolgens gedurende 24 uur geïnfecteerd met ZIKV (MOI=1). De eiwitniveaus van ISG15, ISG56 en GAPDH werden gedetecteerd met Western-blot. MU251-cellen werden 24 uur getransfecteerd met HA-vector, HA-DHCR7 of HA-DHCR7 (G410S) en 6 uur geïnfecteerd met ZIKV (MOI=1/4). De IFN-RNA-niveaus werden gedetecteerd door RT-PCR met GAPDH als interne controle. NU251-cellen werden 24 uur getransfecteerd met HA-vector, HA-DHCR7 of HA-DHCR7 (G410S) en vervolgens 24 uur geïnfecteerd met ZIKV (MOI=1). De eiwitniveaus van ISG15, ISG56 en GAPDH werden gedetecteerd met Western-blot. Gegevens zijn afkomstig van ten minste drie onafhankelijke experimenten (gemiddelde SD) of representatieve gegevens (I, J, L, N). De statistische significantie wordt berekend met behulp van eenweg-ANOVA met de meervoudige vergelijkingstest van Dunnett (A, B, K, M) of tweeweg-ANOVA met de meervoudige vergelijkingstest van Sidak (C – H). ns, P > 0,05, ***P <0,001. SD, standaarddeviatie.

Fig. 5. DHCR7 remt de activering van TBK1 en IRF3. A, B HEK293T-cellen werden gecotransfecteerd met TBK1--coderend plasmide samen met DHCR7- tot expressie brengend plasmide of lege vector (A). HEK293T-cellen werden gecotransfecteerd met IRF3-coderend plasmide, RIG-I-coderend plasmide, samen met DHCR7-tot expressie brengend plasmide of lege vector (B). Cellen werden 24 uur na transfectie geoogst en onderworpen aan Western blot met aangegeven antilichamen [anti-TBK1, anti-P-TBK1 (S172), anti-IRF3, anti-PIRF3 (S396), anti-HA en anti-GAPDH ]. CU251-cellen werden 24 uur getransfecteerd met de aangegeven dosis DHCR7 tot expressie brengend plasmide of lege vector. Cellen werden vervolgens geïnfecteerd met ZIKV (MOI=1), geoogst 6 uur na infectie en onderworpen aan Western blot met aangegeven antilichamen [anti-TBK1, anti-P-TBK1 (S172), anti-IRF3, anti-P-IRF3 ( S396), anti-HA en anti-GAPDH]. DU251-cellen werden 24 uur getransfecteerd met HA-vector, HA-DHCR7 of HA-DHCR7 (G410S). Cellen werden vervolgens geïnfecteerd met ZIKV (MOI=1), geoogst 6 uur na infectie en onderworpen aan Western blot met aangegeven antilichamen [anti-TBK1, anti-P-TBK1 (S172), anti-IRF3, anti-PIRF3 (S396) , anti-HA en anti-GAPDH]. EU251-cellen werden gedurende 2 uur behandeld met de aangegeven dosis AY9944 en gedurende 6 uur geïnfecteerd met ZIKV (MOI=1), vervolgens onderworpen aan Western blot met aangegeven antilichamen [anti-TBK1, anti-P-TBK1 (S172), anti-TBK1 -IRF3, anti-P-IRF3 (S396) en anti-GAPDH]. Gegevens zijn afkomstig van ten minste drie onafhankelijke experimenten en weergegeven als representatieve gegevens (A – E).

Fig. 6. ZIKV NS4B interageert met DHCR7 om de fosforylering van TBK1 en IRF3 te remmen. A HEK293T-cellen werden gecotransfecteerd met plasmiden die coderen voor HA-DHCR7, en plasmiden die coderen voor niet-structurele ZIKV-eiwitten (FLAG-NS1, FLAG-NS3, FLAG-NS4A, FLAG-NS4B en FLAG-NS5) of leeg controleplasmide gedurende 3 0 u. De cellysaten werden immunologisch neergeslagen met anti-Flag-antilichamen en vervolgens geanalyseerd door immunoblotting met aangegeven antilichamen. B-, CHEK293T-cellen werden gedurende 30 uur gecotransfecteerd met plasmiden die coderen voor HA-DHCR7, plasmiden die coderen voor FLAG-NS4B, of een leeg controleplasmide. De cellysaten werden immunologisch neergeslagen met anti-HA-antilichaam (B) of anti-FLAG-antilichaam (C) en vervolgens geanalyseerd door immunoblotting met aangegeven antilichamen. DU251-cellen werden getransfecteerd met FLAG-NS4B-plasmide samen met plasmiden die coderen voor HA-DHCR7. De lokalisatie van FLAG-NS4B (groen), HA-DHCR7 (rood), kernmarker DAPI (blauw) en samenvoeging werden geanalyseerd met confocale microscopie. Schaalbalk ¼ 10 μm. E-cellysaten van HEK293T-cellen getransfecteerd met HA-DHCR7 werden geïncubeerd met GST-eiwit of GST-NS4B-eiwit dat werd geïncubeerd met glutathion-Sepharose-kralen. Mengsels werden gedetecteerd met Western-blot met anti-HA- en anti-GST-antilichamen (boven). Lysaten van getransfecteerde HEK293T-cellen en de gezuiverde eiwitten werden gedetecteerd door Western-blot met anti-HA- en anti-GST-antilichamen (onder). FU251-cellen werden getransfecteerd met plasmide dat codeert voor FLAG-NS4B (0, 1, 2 ug). De relatieve eiwitniveaus van DHCR7, FLAG-NS4B en GAPDH werden gedetecteerd met Western-blot. G-, H HEK293T-cellen werden gecotransfecteerd met plasmide dat NS4B tot expressie brengt of een lege vector, samen met TBK1-coderend plasmide (F), IRF3-tot expressie brengend plasmide, en plasmiden die coderen voor RIG-I (G) . Cellen werden 24 uur na transfectie geoogst en onderworpen aan Western blot met aangegeven antilichamen [anti-TBK1, anti-P-TBK1 (S172), anti-IRF3, anti-P-IRF3 (S396), anti-FLAG en antiGAPDH ]. I DHCR7-silencing U251 (sh-DHCR7) en sh-NTC U251-cellen werden getransfecteerd met plasmide dat NS4B tot expressie brengt of met lege vector. Cellen werden 6 uur na transfectie geoogst en onderworpen aan Western blot met aangegeven antilichamen [anti-TBK1, anti-P-TBK1 (S172), anti-IRF3, anti-P-IRF3 (S396), anti-FLAG en antiGAPDH ]. Gegevens zijn representatief voor drie onafhankelijke experimenten.

5. Conclusies

Samenvattend bleek uit een eerdere studie dat het cholesterolmetabolisme-enzym DHCR7 betrokken is bij de aangeboren immuunrespons tegen verschillende virale infecties. Onze studie heeft aangetoond dat ZIKV NS4B een interactie aanging met DHCR7 en DHCR7-expressie induceerde. De verhoogde DHCR7 remt de activering van TBK1 en IRF3 in hoge mate en resulteert in verminderde IFN- en ISG-productie, wat dus ZIKV-infectie in gliacellen vergemakkelijkt. Deze bevindingen hebben een nieuw viraal immuunontsnappingsmechanisme blootgelegd waarmee ZIKV de immuunrespons overwint door zich rechtstreeks op DHCR7 te richten met NS4B.

Referenties

Akula, MK, Shi, M., Jiang, Z., Foster, CE, Miao, D., Li, AS, Zhang, X., Gavin, RM, Forde, SD, Germain, G., Carpenter, S., Rosadini, CV, Gritsman, K., Chae, JJ, Hampton, R., Silverman, N., Gravallese, EM, Kagan, JC, Fitzgerald, KA, Kastner, DL, Golenbock, DT, Bergo, MO, Wang, D ., 2016. Controle van de aangeboren immuunrespons door de mevalonaatroute. Nat. Immunol. 17, 922-929.

Berthoud, L., 2020. De beperking van flavivirussen. Virol. Zonde. 35, 363-377.

Blanc, M., Hsieh, WY, Robertson, KA, Kropp, KA, Forster, T., Shui, G., Lacaze, P., Watterson, S., Griffiths, SJ, Spann, NJ, Meljon, A., Talbot, S., Krishnan, K., Covey, DF, Wenk, MR, Craigon, M., Ruzsics, Z., Haas, J., Angulo, A., Griffiths, WJ, Glass, CK, Wang, Y. , Ghazal, P., 2013. De transcriptiefactor STAT-1 koppelt de macrofaagsynthese van 25-hydroxycholesterol aan de antivirale respons op interferon. Immuniteit 38, 106–118.

Cao-Lormeau, V.-M., Blake, A., Bergen, S., Lastere, S., Roche, C., Vanhomwegen, J., Dub, T., Baudouin, L., Teissier, A., Larre, P., Vial, A.-L., Decam, C., Choumet, V., Halstead, SK, Willison, HJ, Musset, L., Manuguerra, J.-C., Despres, P., Fournier , E., Mallet, H.-P., Musso, D., Fontanet, A., Neil, J., Ghawche, F., 2016. Uitbraak van het Guillain-Barre-syndroom geassocieerd met Zika-virusinfectie in Frans-Polynesië: een geval -controlestudie. Lancet 387, 1531-1539.

Chazal, M., Beauclair, G., Gracias, S., Najburg, V., Simon-Loriere, E., Tangy, F., Komarova, AV, Jouvenet, N., 2018. RIG-I herkent de 5' regio van dengue- en Zika-virusgenomen. Celvertegenwoordiger 24, 320-328.

Chen, Q., Gouilly, J., Ferrat, YJ, Espino, A., Glaziou, Q., Cartron, G., El Costa, H., AlDaccak, R., Jabrane-Ferrat, N., 2020. Metabolisch herprogrammering door het Zika-virus veroorzaakt ontstekingen in de menselijke placenta. Nat. Gemeenschappelijk. 11, 2967. Dang, EV, McDonald, JG, Russell, DW, Cyster, JG, 2017. Oxysterol-beperking van de cholesterolsynthese voorkomt AIM2-ontstekingsactivatie. Cel 171, 1057–1071 e1011.

Ding, Q., Cao, X., Lu, J., Huang, B., Liu, YJ, Kato, N., Shu, HB, Zhong, J., 2013. Hepatitis C-virus NS4B blokkeert de interactie van STING en TBK1 om de aangeboren immuniteit van de gastheer te omzeilen. J. Hepatol. 59, 52–58.

Fanunza, E., Grandi, N., Quartu, M., Carletti, F., Ermellino, L., Milia, J., Corona, A., Capobianchi, MR, Ippolito, G., Tramontano, E., 2021 INMI1 Zika-virus NS4B antagoneert de interferonsignalering door STAT1-fosforylering te onderdrukken. Virussen 13, 2448.

Fitzgerald, KA, McWhirter, SM, Faia, KL, Rowe, DC, Latz, E., Golenbock, DT, Coyle, AJ, Liao, SM, Maniatis, T., 2003. IKKε en TBK1 zijn essentiële componenten van de IRF3-signalering pad. Nat. Immunol. 4, 491–496.

Fitzky, BU, Witsch-Baumgartner, M., Erdel, M., Lee, JN, Paik, Y.-K., Glossmann, H., Utermann, G., Moebius, FF, 1998. Mutaties in de Δ{{ 3}}sterolreductasegen bij patiënten met het Smith-Lemli-Opitz-syndroom. Proc. Nat. Acad. Wetenschap VS 95, 8181-8186.

Gorman, MJ, Caine, EA, Zaitsev, K., Begley, MC, Weger-Lucarelli, J., Uccellini, MB, Tripathi, S., Morrison, J., Yount, BL, Dinnon 3e, KH, Ruckert, C ., Jong, MC, Zhu, Z., Robertson, SJ, McNally, KL, Ye, J., Cao, B., Mysorekar, IU, Ebel, GD, Baric, RS, Beste, SM, Artyomov, MN, Garcia -Sastre, A., Diamond, MS, 2018. Een immunocompetent muismodel van Zika-virusinfectie. Celgastheermicrobe 23, 672–685.e6.

Grant, A., Ponia, SS, Tripathi, S., Balasubramaniam, V., Miorin, L., Sourisseau, M., Schwarz, MC, Sanchez-Seco, MP, Evans, MJ, Best, SM, Garcia-Sastre , A., 2016. Het Zika-virus richt zich op menselijk STAT2 om de type I-interferonsignalering te remmen. Celgastheermicrobe 19, 882-890.

Hertzog, J., Dias Junior, AG, Rigby, RE, Donald, CL, Mayer, A., Sezgin, E., Song, C., Jin, B., Hublitz, P., Eggeling, C., Kohl, A., Rehwinkel, J., 2018. Infectie met een Braziliaans isolaat van het Zika-virus genereert RIG-I-stimulerend RNA en het virale NS5-eiwit blokkeert type I IFN-inductie en -signalering. EUR. J. Immunol. 48, 1120–1136.

Horlick, L., 1966. Effect van een nieuwe remmer van de biosynthese van cholesterol (AY 9944) op serum- en weefselsterolen bij de rat. J. Lipide Res. 7, 116–121.

Ikonen, E., 2008. Handel in cellulaire cholesterol en compartimentering. Nat. Ds. Mol. Cel Biol. 9, 125–138.

Kato, H., Takeuchi, O., Sato, S., Yoneyama, M., Yamamoto, M., Matsui, K., Uematsu, S., Jung, A., Kawai, T., Ishii, KJ, Yamaguchi , O., Otsu, K., Tsujimura, T., Koh, CS, Reis e Sousa, C., Matsuura, Y., Fujita, T., Akira, S., 2006. Differentiële rollen van MDA5 en RIG-I helicasen bij de herkenning van RNA-virussen. Natuur 441, 101–105.

Kuan, V., Martineau, AR, Griffiths, CJ, Hypp€onen, E., Walton, R., 2013. DHCR7-mutaties gekoppeld aan een hogere vitamine D-status maakten vroege menselijke migratie naar noordelijke breedtegraden mogelijk. BMC Evol. Biol. 13, 144.

Kumar, A., Hou, S., Airo, AM, Limonta, D., Mancinelli, V., Branton, W., Power, C., Hobman, TC, 2016. Zika-virus remt de productie van interferon type I en stroomafwaarts signalering. EMBO Rep. 17, 1766–1775.

Lazear, HM, Govero, J., Smith, AM, Platt, DJ, Fernandez, E., Miner, JJ, Diamond, MS, 2016. Een muismodel van de pathogenese van het Zika-virus. Celgastheermicrobe 19, 720-730. Lee, LJ, Komarasamy, TV, Adnan, NAA, James, W., Rmt Balasubramaniam, V., 2021. Verstoppertje: het samenspel tussen het Zika-virus en de immuunrespons van de gastheer. Voorkant. Immunol. 12, 750365.

Leier, HC, Weinstein, JB, Kyle, JE, Lee, JY, Bramer, LM, Stratton, KG, Kempthorne, D., Navratil, AR, Tafesse, EG, Hornemann, T., Messer, WB, Dennis, EA, Metz, TO, Barklis, E., Tafesse, FG, 2020. Een mondiale lipidenkaart definieert een netwerk dat essentieel is voor de replicatie van het Zika-virus. Nat. Gemeenschappelijk. 11, 3652.

Li, A., Wang, W., Wang, Y., Chen, K., Xiao, F., Hu, D., Hui, L., Liu, W., Feng, Y., Li, G., Tan, Q., Liu, Y., Wu, K., Wu, J., 2020. Conservatieve NS5-site is vereist voor het Zika-virus om de RIG-I-signalering te beperken. Voorkant. Immunol. 11, 51.

Li, C., Deng, YQ, Wang, S., Ma, F., Aliyari, R., Huang, XY, Zhang, NN, Watanabe, M., Dong, HL, Liu, P., Li, XF, Ye, Q., Tian, ​​M., Hong, S., Fan, J., Zhao, H., Li, L., Vishlaghi, N., Buth, JE, Au, C., Liu, Y., Lu , N., Du, P., Qin, FX, Zhang, B., Gong, D., Dai, X., Sun, R., Novitch, BG, Xu, Z., Qin, CF, Cheng, G. , 2017. 25- Hydroxycholesterol beschermt de gastheer tegen Zika-virusinfectie en de daarmee samenhangende microcefalie in een muismodel. Immuniteit 46, 446–456.

Liu, CI, Liu, GY, Song, Y., Yin, F., Hensler, ME, Jeng, WY, Nizet, V., Wang, AH, Oldfield, E., 2008. Een cholesterolbiosyntheseremmer blokkeert de virulentie van Staphylococcus aureus . Wetenschap 319, 1391–1394.

Liu, SY, Aliyari, R., Chikere, K., Li, G., Marsden, MD, Smith, JK, Pernet, O., Guo, H., Nusbaum, R., Zack, JA, Freiberg, AN, Su, L., Lee, B., Cheng, G., 2013. Interferon-induceerbaar cholesterol-25-hydroxylase remt in grote lijnen het binnendringen van virussen door de productie van 25- 25-hydroxycholesterol. Immuniteit 38, 92–105.

Luo, J., Yang, H., Song, BL, 2020. Mechanismen en regulering van cholesterolhomeostase. Nat. Ds. Mol. Cel Biol. 21, 225–245.

Luu, W., Hart-Smith, G., Sharpe, LJ, Brown, AJ, 2015. De terminale enzymen van de cholesterolsynthese, DHCR24 en DHCR7, werken fysiek en functioneel samen. J. Lipide Res. 56, 888-897.

Ma, J., Ketkar, H., Geng, T., Lo, E., Wang, L., Xi, J., Sun, Q., Zhu, Z., Cui, Y., Yang, L., Wang, P., 2018. Niet-structureel eiwit 4A van het Zika-virus blokkeert de RLR-MAVS-signalering. Voorkant. Microbiol. 9, 1350. Moebius, FF, Fitzky, BU, Lee, JN, Paik, YK, Glossmann, H., 1998.

Moleculaire klonering en expressie van het menselijke delta7-sterolreductase. Proc. Nat. Acad. Wetenschap VS 95, 1899–1902.

Munoz-Jordan, JL, Laurent-Rolle, M., Ashour, J., Martinez-Sobrido, L., Ashok, M., Lipkin, WI, Garcia-Sastre, A., 2005. Remming van alfa / bèta-interferonsignalering door het NS4B-eiwit van flavivirussen. J. Virol. 79, 8004–8013.

Munoz-Jordan, JL, Sanchez-Burgos, GG, Laurent-Rolle, M., Garcia-Sastre, A., 2003. Remming van interferonsignalering door dengue-virus. Proc. Nat. Acad. Wetenschap VS 100, 14333–14338.

Petersen, J., Drake, MJ, Bruce, EA, Riblett, AM, Didigu, CA, Wilen, CB, Malani, N., Man, F., Lee, FH, Bushman, FD, Cherry, S., Doms, RW, Bates, P., Briley Jr., K., 2014. De belangrijkste cellulaire sterolregulerende route is vereist voor infectie met het Andes-virus. PLoS-pathog. 10, e1003911.

Pierson, TC, Diamond, MS, 2020. De voortdurende dreiging van opkomende flavivirussen. Nat. Microbiol. 5, 796–812. Prabhu, AV, Luu, W., Li, D., Sharpe, LJ, Brown, AJ, 2016a. DHCR7: een essentiële enzymschakelaar tussen de productie van cholesterol en vitamine D. Prog. Lipide Res. 64, 138–151.

Prabhu, AV, Luu, W., Sharpe, LJ, Bruin, AJ, 2016b. Cholesterolgemedieerde afbraak van 7-dehydrocholesterolreductase verandert de balans van cholesterol- naar vitamine D-synthese. J. Biol. Chem. 291, 8363-8373. Randall, G., 2018. Metabolisme van lipidendruppels tijdens dengue-virusinfectie. Trends Microbiol. 26, 640-642.

Rasmussen, SA, Jamieson, DJ, Honein, MA, Petersen, LR, 2016. Zika-virus en geboorteafwijkingen – beoordeling van het bewijsmateriaal voor causaliteit. N. Engels. J. Med. 374, 1981-1987.

Reboldi, A., Dang, EV, McDonald, JG, Liang, G., Russell, DW, Cyster, JG, 2014. Ontsteking. 25-Hydroxycholesterol onderdrukt door interleukine-1- veroorzaakte ontstekingen stroomafwaarts van type I interferon. Wetenschap 345, 679–684.

Riedl, W., Acharya, D., Lee, JH, Liu, G., Sherman, T., Chiang, C., Chan, YK, Diamond, MS, Gack, MU, 2019. Zika-virus NS3 bootst een cellulaire { {2}}bindend motief om RIG-I- en MDA5-gemedieerde aangeboren immuniteit tegen te werken. Celgastheermicrobe 26, 493–503 e496.

Rodgers, MA, Villareal, VA, Schaefer, EA, Peng, LF, Corey, KE, Chung, RT, Yang, PL, 2012. Profilering van lipidenmetabolieten identificeert het desmosterolmetabolisme als een nieuw antiviraal doelwit voor het hepatitis C-virus. J. Am. Chem. Soc. 134, 6896-6899. Savidis, G., Perreira, JM, Portmann, JM, Meraner, P., Guo, Z., Green, S., Brass, AL, 2016. De IFITM's remmen de replicatie van het Zika-virus. Celvertegenwoordiger 15, 2323–2330.

Schneider, WM, Chevillotte, MD, Rice, CM, 2014. Interferon-gestimuleerde genen: een complex web van gastheerverdedigingen. Jaar. Ds. Immunol. 32, 513-545.