Dihydroquercetine verbetert door LPS geïnduceerde neuro-inflammatie en geheugentekortⅡ

3. Resultaten

3.1. DHQ verbeterde door LPS geïnduceerde veranderingen in de geheugengedragstest voor ruimtelijke herkenning in de Y-doolhof-test

We hebben een geheugengedragstest voor ruimtelijke herkenning uitgevoerd in Y-doolhof om het effect van DHQ op LPS-geïnduceerd geheugentekortgedrag te evalueren. Statistische analyse met behulp van tweeweg-ANOVA bracht significante verschillen aan het licht in het percentage armingangen in trial-1 en trial-2 tussen groepen [F (4, 80) ¼ 2,23, p < {{15 }}.05], arm [F (1, 80)=84,8, p < 0,05] en een significante interactie tussen groepen en arm [F (4, 80)=88,3, p < 0,05].

Klik op Rou cong rong voor geheugenverbetering

Verdere analyse met behulp van een post-hoc-test toonde een aanzienlijk verlies aan in het geheugengedrag voor ruimtelijke herkenning bij LPS-toediening in vergelijking met controleratten. Er waren significante verschillen tussen de controle-, LPS-, DHQ0.5- en 1 ug/kg-groepen. Behandeling met 2 µg/kg verzwakte het door LPS veroorzaakte verlies van ruimtelijk herkenningsgeheugen. DHQ-0.5 en DHQ-1 ug/kg vertoonden echter geen verandering in het LPS-geïnduceerde verlies in het ruimtelijke herkenningsgeheugen. Het wordt getoond in figuur 2(a).

3.2. DHQ verbeterde door LPS veroorzaakte veranderingen in de nieuwsgierigheidsgedragstest in de Ymaze-test

We onderzochten het effect van DHQ op nieuwsgierigheidsgedrag op dag{{0}} zoals weergegeven in figuur 2(b) hieronder. We vonden significante verschillen in proef-1 en proef-2 tussen groepen [F (4, 80) ¼ 1,77, p < 0.05], arm [F ( 1, 80)=83,9, p < 0,05] en een significante interactie tussen groepen en arm [F (4, 50)=99,7, p < 0,05] bij analyse met tweeweg-ANOVA.

De post-hoc-test onthulde dat het nieuwsgierigheidsgedrag aanzienlijk was verminderd met LPS-toediening in vergelijking met controleratten. Behandeling van DHQ-2 ug/kg verzwakte de door LPS veroorzaakte afname van het nieuwsgierigheidsgedrag. DHQ-0.5 ug/kg veroorzaakte echter geen verandering in de LPS-geïnduceerde afname van het nieuwsgierigheidsgedrag. Het effect van DHQ-2 ug/kg bleek significanter te zijn dan DHQ-1 ug/kg bij het verbeteren van de LPS-geïnduceerde afname van nieuwsgierigheidsgedrag.

3.3. DHQ verbeterde het werkgeheugen in de Y-maze-test

Het effect van DHQ op ruimtelijk geheugenverlies op dag {{0}} na LPS-injectie in de Y-doolhof-test wordt weergegeven in figuur 2(c) hieronder. Statistische analyse met eenrichtings-ANOVA toonde aan dat er significante verschillen waren in spontaan veranderingsgedrag in het Y-doolhof-testparadigma tussen groepen [F (4, 40)=128, p < 0,05]. De post-hoc-test onthulde dat het spontane veranderingsgedrag significant was verminderd met LPS-toediening in vergelijking met controleratten.

Er werden ook significante verschillen gevonden tussen de controle- en DHQ 0.5 en 1 ug/kg groepen. Behandeling van DHQ met 1 ug/kg en 2 ug/kg verzwakte de LPS-geïnduceerde afname van het spontane veranderingsgedrag, wat wijst op een toename van het werkgeheugen. Het effect van DHQ-2 ug/kg bleek significanter te zijn dan DHQ-1 ug/kg, terwijl DHQ-0.5 ug/kg geen verandering veroorzaakte in de LPS- geïnduceerde afname van het werkgeheugen.

3.4. DHQ verzachtte door LPS veroorzaakte wijzigingen in de overdrachtslatentie (TL) in de EPM-gedragstest

Om het ruimtelijk langetermijngeheugen te evalueren, bestudeerden we het effect van DHQ op de overdrachtslatentie op dag-9 en dag-10 na LPS-injectie in de EPM-test, zoals weergegeven in figuur 3(a) hieronder. Statistische analyse met behulp van tweeweg-ANOVA onthulde significante verschillen in trial-1 en trial-2 tussen groepen [F (4, 80) ¼ 403,1, P < 0.00 .05], tijd [F (1, 80) ¼ 781,4, p< 0.05] and a significant interaction between groups and time [F (4, 80) ¼ 15.11, p < 0.05]. 

De post-hoc-test onthulde dat LPS-injectie de TL aanzienlijk verhoogde in vergelijking met controleratten. Uit gegevens blijkt dat de TL van de controlegroep significant verschilde van die van alle andere groepen op dag-10 maar op dag-9 was de TL van de controlegroep significant verschillend van LPS, DHQ{{3} }.5, en slechts 1 ug/kg. DHQ-0.5 ug/kg veroorzaakte geen verandering in de LPS-geïnduceerde toename van de TL. De LPS-geïnduceerde toename van de TL werd echter significant afgezwakt met DHQ-1 ug/kg en DHQ-2 ug/kg.

3.5. DHQ verhoogde open-arm-items in de EPM-gedragstest

Angstgedrag wordt bij knaagdieren veroorzaakt door de inductie van LPS. Het effect van DHQ op het percentage open arm-ingangen op de dag{{0}} na LPS-injectie in de EPM-test wordt weergegeven in figuur 3(b) hieronder. One-way ANOVA liet significante verschillen zien in het percentage open-arm-ingangen tussen groepen [F (4, 40)=101, p < 0,05].

De post-hoc-test onthulde dat LPS-injectie het percentage open-armingangen aanzienlijk verlaagde in vergelijking met controleratten. Uit gegevens bleek dat er significante verschillen waren tussen de controlegroep en alle andere groepen. DHQ-0.5 ug/kg veroorzaakte geen verandering in de LPS-geïnduceerde afname van het percentage open-arm binnenkomsten. De LPS veroorzaakte echter een afname van het percentage open-arm-ingangen, aanzienlijk verbeterd met toediening van DHQ-1 ug/kg en DHQ-2 ug/kg.

3.6. DHQ verlichtte LPS-geïnduceerde veranderingen in de openarmtijd doorgebracht in de EPM-gedragstest

Analyse van gedragsgegevens met behulp van one-way ANOVA liet significante verschillen zien in de tijd die met open armen werd doorgebracht tussen groepen [F (4, 40)=292,2, p< 0.05]. The post-hoc test revealed that LPS injection significantly decreased the percentage of open-arm time spent compared to control rats. Statistical data also showed that time spent in the open arm by the control group was significantly different from all other groups. DHQ-0.5 μg/kg caused a significant change to the LPS-induced decrease in the open arm time spent. However, the LPS induced a decrease in the open arm time spent significantly improved with DHQ-1 μg/kg and DHQ-2 μg/kg even more significant than DHQ-0.5 μg/kg. It is shown in Fig. 3(c).

3.7. DHQ vertoonde geen effect op het totale aantal armitems in de EPM-gedragstest

Het effect van DHQ op het totale aantal armingangen op dag {{0}} na LPS-injectie in de EPM-test wordt weergegeven in figuur 3(d) hieronder. Statistische analyse met behulp van one-way ANOVA had geen significant verschil aangetoond in totale arminvoer tussen groepen [F (4, 40)=0,894, p < 0,05]. De post-hoc-test onthulde dat LPS-injectie geen significante veranderingen veroorzaakte in de totale armingangen tussen de groepen. Geen van de DHQ-doses veroorzaakte significante veranderingen in het totale aantal arminvoeren.

3.8. DHQ verminderde dosisafhankelijk LPS-geïnduceerde veranderingen in immobiliteitsperiode in EPM-gedragstest

Het effect van DHQ op de immobiliteitsperiode op dag {{0}} na LPS-injectie in de EPM-test wordt weergegeven in figuur 3(e) hieronder. One-way ANOVA onthulde significante verschillen in de immobiliteitsperiode tussen groepen [F (4, 40)=138,3, p < 0,05]. De post-hoc-test toonde aan dat LPS-injectie de immobiliteitsperiode aanzienlijk verlengde in vergelijking met controleratten. DHQ0.5 bleek geen veranderingen te veroorzaken in de LPS-geïnduceerde toename van de immobiliteitsperiode.

De periode van immobiliteit in de controlegroep was significant korter dan bij LPS en DHQ-0.5 en 1 ug/kg. De LPS-geïnduceerde toename van de immobiliteitsperiode werd echter significant afgezwakt met DHQ-1 ug/kg en DHQ-2 ug/kg, DHQ-2 ug/kg verminderde de immobiliteitsperiode significanter dan DHQ-1 ug/kg.

3.9. DHQ verbeterde de gemiddelde bloedtoevoer naar de hersenen, veranderd door LPS-inductie

Het effect van DHQ op de gemiddelde cerebrale doorbloeding werd geëvalueerd op dag 10 na LPS-injectie met behulp van een laser-Doppler-imager, weergegeven in Fig. 4 hieronder. Statistische analyse met eenrichtings-ANOVA bracht significante verschillen tussen de groepen aan het licht [F (4 , 25)=41,9, p < 0,05]. De post-hoc-test onthulde dat LPS-injectie een significante vermindering van de gemiddelde bloedtoevoer naar de hersenen veroorzaakte in vergelijking met controleratten.

De bloedstroom bij controleratten was ook significant verschillend in vergelijking met DHQ-0.5 en 1 ug/kg. DHQ-0.5 ug/kg en DHQ-1 ug/kg veroorzaakten echter geen verandering in de LPS-geïnduceerde afname van de gemiddelde bloedstroom. De LPS-geïnduceerde daling van de gemiddelde bloedstroom was echter significant verbeterd met DHQ-2 ug/kg.

3.10. DHQ herstelde het niveau van acetylcholine veranderd door LPS-inductie

Acetylcholine is een van de dominante neurotransmitters in de hersenen die betrokken zijn bij leren en geheugen (Myhrer, 2003). Het effect van DHQ op LPS-geïnduceerde veranderingen in het niveau van acetylcholine wordt weergegeven in figuur 5(a) hieronder. One-way ANOVA toonde rekenkundige verschillen in de concentratie van acetylcholine tussen groepen [F (4, 10)=337, p < 0,05].

De post-hoc-test wees uit dat LPS-injectie de acetylcholinespiegels in de hippocampusregio aanzienlijk verlaagde in vergelijking met die van de controlegroep. DHQ-0.5 ug/kg veroorzaakte geen significante verandering in de LPS-geïnduceerde afname van de acetylcholineconcentratie. De LPS-geïnduceerde afname van de acetylcholineconcentratie nam echter significant toe met DHQ-1 ug/kg en DHQ-2 ug/kg. De door DHQ-2 ug/kg gemedieerde verhoging van de acetylcholineconcentratie was echter significanter dan de DHQ-1 ug/kg.

3.11. Effect van DHQ op LPS-geïnduceerde veranderingen in de acetylcholine-esterase-activiteit

Het effect van DHQ op LPS-geïnduceerde veranderingen in de AchE-activiteit na LPS-injectie wordt weergegeven in figuur 5(b) hieronder. One-way ANOVA toonde significante verschillen in AchE-activiteit tussen groepen [F (4, 10)=482, p< 0.05]. It was further proved by the post-hoc test that LPS injection significantly increased the AchE activity compared to the control group rats.

De gegevens toonden verder aan dat de AchE-activiteit van de controlegroep ook aanzienlijk minder was dan die van alle resterende groepen. DHQ-0.5 ug/kg veroorzaakte geen significante verandering in de LPS-geïnduceerde toename van de AchE-activiteit. De LPS veroorzaakte echter een toename van de AchE-activiteit, aanzienlijk verzwakt met DHQ-1 ug/kg en DHQ-2 ug/kg. DHQ-2 ug/ kg gemedieerde vermindering van de AchE-activiteit was significanter dan DHQ-1 ug/kg.

3.12. DHQ verminderde pro-inflammatoire IL-6 bij LPS-geïnduceerde dieren

We bestudeerden het effect van DHQ op een inflammatoire cytokine IL{{0}} na LPS-inductie zoals weergegeven in Fig. 6 hieronder. Statistische analyse onthulde significante verschillen in de concentratie van IL-6 in de verschillende groepen. Er waren significante verschillen tussen de groepen [F (4, 10)=3016, p < 0,05] volgens one-way ANOVA.

De post-hoc test wees uit dat LPS-injectie een stijging van het niveau van IL-6 veroorzaakte in vergelijking met controleratten. De IL-6-concentratie was statistisch verschillend tussen de groepen in vergelijking met de controlegroep. DHQ-0.5, 1 en 2 ug/kg vertoonden significante veranderingen in de LPS-geïnduceerde verhoging van het IL-6-niveau. De door DHQ-2 ug/kg gemedieerde verlaging van het niveau van IL-6 was echter het meest significant in vergelijking met de andere twee doses. DHQ-1 ug/kg bleek significanter te zijn dan DHQ-0.5 ug/kg.

3.13. DHQ vertoonde antioxiderende activiteiten

We hebben ook de antioxiderende eigenschappen van DHQ onderzocht. Fig. 7 toont het effect van DHQ op de antioxidant-enzymen bij LPS-inductie. Eenzijdige ANOVA onthulde significante verschillen tussen de groepen [F (4,10)=186,7, p < 0.05], MDA [F (4, 10)=47,40, p < 0,05] en NO [F (4, 10)=18,76, P < 0,05] niveaus.

De post-hoc-test onthulde dat LPS-injectie de CAT-activiteit aanzienlijk verlaagde en de LPO-activiteit verhoogde, en het NO-niveau verhoogde in vergelijking met de controlegroep. De CAT-activiteit werd aanzienlijk gestimuleerd door toediening van DHQ-2 ug/kg. Bovendien werd de LPO-activiteit aanzienlijk verminderd met DHQ-0.5, 1 en 2 ug/kg. DHQ-1 en 2 ug/kg maar niet DHQ-0.5 ug/kg toediening verminderde de NO-activiteit aanzienlijk in vergelijking met de LPS-groep.

4. Discussie

Het opvallende kenmerk van deze studie is dat DHQ een multimodaal werkingsmechanisme vertoonde door LPS-geïnduceerde neuro-inflammatie en cognitieve tekorten te verlichten. De relatie tussen neuro-inflammatie en leren en geheugen is goed vastgesteld door middel van preklinische en klinische studies (Liu et al., 2012). Y-doolhof is een van de meest gebruikte doolhoven om leren en geheugen in diermodellen te evalueren.

De spontane afwisselingsgedragstest is een indicatie van actief retrograde werkgeheugen in de Y-Maze-test (Onaolapo et al., 2012). LPS verminderde het afwisselingsgedrag in de Y-Maze-test, wat duidt op tekorten in het werkgeheugen.

Zoals getoond in Fig. 2 (c) minimaliseerden DHQ-1 en 2 ug/kg het door LPS veroorzaakte verlies in het werkgeheugen aanzienlijk. Er werd ook gevonden dat DHQ-1 en 2 µg/kg verzwakt LPS een afname in de nieuwe arm induceerde en een toename in bekende arminvoer zoals in Fig. 2 (b). Daarom verbeterde het geheugen voor ruimtelijke herkenning.

De Y-maze-studie toonde ook aan dat er een significante verbetering was in het ruimtelijk geheugen met DHQ-2 ug/kg na LPS-injectie, zoals getoond in Fig. 2a. Het is aangetoond dat de toediening van DHQ het ruimtelijk geheugen verbetert in een met oligomeer-A behandeld knaagdiermodel (Wang et al., 2018).

Eerdere studies (Frühauf-Perez et al., 2018) toonden aan dat LPS-injectie het langetermijngeheugen verstoort. Zoals weergegeven in Fig. 3 (a), verbeterde DHQ in de dosis van 1 en 2 ug / kg behandeling het langetermijngeheugen in de TL-gedragstest. Vergeleken met dag-9 vertoonde TL dag-10 een significante vermindering; dit betekent een verbetering van het langetermijngeheugen. Een eerdere studie (Swiergiel en Dunn, 2007) toonde aan dat LPS-injectie angstachtig gedrag veroorzaakte, aangezien het leidde tot een afname van het percentage binnenkomsten en de tijd doorgebracht in de open arm in de EPM-studie.

In onze studie verbeterde DHQ angstachtig gedrag aanzienlijk volgens figuur 3 (c). LPS-infusie vertoonde geen enkel effect op de locomotorische activiteit van proefdieren volgens de totale arminvoergegevens, wat aantoont dat motorische functies niet werden belemmerd zoals in Fig. 3 (c). Neuro-inflammatie vermindert de cerebrale gemiddelde bloedstroom (CBF) en veroorzaakt cellulaire stress, wat zou kunnen bijdragen aan cognitieve defecten (Zlokovic, 2005).

Het mechanisme ervan kan een disfunctie van de neurovasculaire eenheid inhouden, wat leidt tot een foutieve klaring van neurotoxische moleculen van de hersenen naar het bloed en een onevenwichtigheid tussen het energiemetabolisme en de levering van voeding (Zlokovic, 2008). In deze studie verlaagde LPS-injectie de gemiddelde CBF en deze afname van de gemiddelde CBF was significant verbeterd met DHQ-2 ug/kg, wat wijst op de anti-neuro-inflammatoire activiteit zoals getoond in Fig. 4.

Het cholinerge systeem speelt een belangrijke rol in het geheugen en de onbalans ervan is betrokken bij neuro-inflammatiepathologie (Nizri et al., 2006). Er is waargenomen dat LPS-inductie een toename in AChE-activiteit veroorzaakte. Daarom is gemeld dat AChE-remmers neuro-inflammatie-geïnduceerde neurodegeneratie verbeteren (Nizri et al., 2006). In deze studie veroorzaakte LPS-inductie een significante daling van het niveau van Ach, zoals weergegeven in figuur 5 (a). en een toename van AChE-activiteit (Fig. 5 (b)). in de hippocampus.

De waargenomen resultaten kunnen te wijten zijn aan de door neuro-inflammatie geïnduceerde neurodegeneratie van cholinerge neuronen in de hippocampus (Kalb et al., 2013). DHQ-1 en 2 ug/kg keerden de door LPS-infusie veroorzaakte veranderingen in ACh-niveau en AChE-activiteit om, zoals weergegeven in respectievelijk Fig. 5 (a) en Fig. 5 (b). Deze gegevens geven aan dat DHQ een gunstig effect kan hebben op het cholinerge systeem in het neuro-inflammatiemodel van LPS.

Een onbalans tussen de productie en eliminatie van ROS in het biologische systeem leidt tot oxidatieve stress, die een cruciale rol speelt in de leeftijdsgebonden cognitieve achteruitgang bij neuro-inflammatie-gerelateerde neurodegeneratieve ziekten zoals de ziekte van Alzheimer en Parkinson (Barnham et al., 2004). De belangrijkste antioxidant-enzymen, waaronder superoxide-dismutase (SOD) en catalase (CAT), worden beschouwd als de eerste lijn van het antioxidant-afweersysteem tegen ROS in vivo tijdens oxidatieve schade.

SOD kan superoxide-anionen omzetten in waterstofperoxide, dat vervolgens wordt weggevangen door CAT (Ighodaro en Akinloye, 2018). MDA is een andere bekende indicator van oxidatieve schade onder de conditie van oxidatieve stress (Chung et al., 2010). NO speelt een cruciale rol bij het leren door langdurige potentiëring in de hippocampus te vergemakkelijken (Bon en Garthwaite, 2003), en is ook betrokken bij intracellulaire signalering in neuronen (Feil en Kleppisch, 2008). Interessant is dat een abnormale toename van reactieve stikstofsoorten ongeoorloofde apoptotische celdood veroorzaakt door nitrosatieve schade aan neuronen (Nakagawa en Yokozawa, 2002).

Verdere analyse onthulde dat LPS-toediening significante remming van het antioxidant-enzym catalase en overactiviteit van bepaalde enzymen zoals LPO en NO veroorzaakte. Het waargenomen resultaat zou te wijten kunnen zijn aan de door neuro-inflammatie geïnduceerde activering van ROS in de hippocampus. Zoals weergegeven in figuur 7 (a) en figuur 7 (b) keerde DHQ-2 ug/kg de LPS-versterkte CAT- en LPO-activiteiten om. LPS-geïnduceerde toename in NO-activiteit werd verminderd door DHQ-1 en alleen 2 ug/kg Fig. 7 (c).

De resultaten toonden aan dat DHQ een antioxiderende eigenschap heeft, zoals eerder gemeld (Weidmann, 2012). LPS is een krachtige activator van microglia en reguleert de ontwikkeling van pro-inflammatoire cytokines, waaronder IL-6 en tumornecrosefactor- (TNF-) (Monje et al., 2003). Onze onderzoeken hebben aangetoond dat LPS-toediening een significante toename van het niveau van IL-6 in de hippocampus veroorzaakte. Zoals getoond in Fig. 6, verlaagde DHQ-2 ug/kg significant het IL-6-niveau in de hippocampus. De resultaten tonen aan dat DHQ een anti-neuro-inflammatoire activiteit heeft (Sah et al., 2011).

Dit effect van DHQ kan worden toegeschreven aan zijn antioxiderende werking, aangezien ROS-opruiming leidt tot een vermindering van IL-6 (Chen et al., 2014; Jain et al., 2009). In de toekomstperspectieven kan het effect van DHQ op door LPS en amyloïde beta geïnduceerde activering van NF-kappa B via toll-like receptor-4-activering in de microgliale cellen worden onderzocht, aangezien NF-kappa B een van de potentiële doelen voor neuro-inflammatie en gerelateerde complicaties zoals dementie (Kim et al., 2015).

5. Conclusie

DHQ heeft LPS-geïnduceerde geheugenstoornissen en angstachtig gedrag bij de rat verbeterd. Het heeft de door LPS geïnduceerde cholinerge disfunctie in de hippocampus geminimaliseerd. Er is ook aangetoond dat het een antioxiderende werking heeft. DHQ heeft anti-neuro-inflammatoire activiteit aangetoond door IL-6 te verminderen, een prominent cytokine dat betrokken is bij neuro-inflammatie. Daarom wijst preklinisch bewijs erop dat DHQ een potentiële kandidaat is voor de behandeling van neuro-inflammatie en andere neurodegeneratieve aandoeningen met geheugenstoornissen.

Het mechanisme van het Cistanche neuroprotectie-effect

Cistanche is een traditioneel Chinees geneeskrachtig kruid waarvan is aangetoond dat het neuroprotectieve effecten heeft. Het exacte mechanisme van zijn werking is niet volledig begrepen, maar er is groeiend bewijs dat het verband kan houden met zijn vermogen om de expressie van neurotrofe factoren te verhogen en bepaalde signaalroutes in de hersenen te reguleren.

Een van de belangrijkste neurotrofe factoren waarvan is aangetoond dat Cistanche deze verhoogt, is de van de hersenen afgeleide neurotrofe factor (BDNF). BDNF is een eiwit dat een sleutelrol speelt bij de groei, differentiatie en instandhouding van neuronen in de hersenen. Studies hebben aangetoond dat wanneer de niveaus van BDNF hoger zijn, er meer neuronale overleving en plasticiteit is, wat kan helpen beschermen tegen neurodegeneratie.

Cistanche is mogelijk ook in staat om bepaalde signaalroutes in de hersenen te reguleren die betrokken zijn bij celoverleving en apoptose (geprogrammeerde celdood). Er is bijvoorbeeld aangetoond dat het de activiteit van de c-Jun N-terminale kinase (JNK)-route remt, wat onder bepaalde omstandigheden kan leiden tot de dood van neuronen. Door JNK te remmen, kan Cistanche helpen neuronen te beschermen tegen schade en hun overleving te behouden.

Bovendien is aangetoond dat Cistanche ontstekingsremmende en antioxiderende effecten heeft, die verder kunnen helpen neuronen te beschermen tegen schade en hun functie te behouden. Deze eigenschappen maken Cistanche tot een veelbelovend therapeutisch middel voor de behandeling van neurodegeneratieve aandoeningen zoals de ziekte van Alzheimer en Parkinson.

Qadir Alam, Sairam Krishnamurthy *

Neurotherapeutisch Laboratorium, Afdeling Farmaceutische Engineering & Technologie, Indian Institute of Technology (Banaras Hindu University), Varanasi, 221005, UP, India