Maagkanker (GC) was de eerste leidende incidentie en tweede belangrijkste sterfte van kankers van het spijsverteringsstelsel

Neem contact oposcar.xiao@wecistanche.comvoor meer informatie

Abstract

Behandeling met platinamedicijnen is een van de meest overheersende chemotherapeutische strategieën voor patiënten met maagkanker (GC). Het therapeutische effect is echter minder dan bevredigend, grotendeels vanwege de verworven resistentie tegen platinageneesmiddelen. Daarom kan een beter begrip van de onderliggende mechanismen de therapeutische werkzaamheid van GC aanzienlijk verbeteren. In deze studie wilden we de chemoresistentie-gerelateerde functies / mechanismen en klinische betekenis van glucose-gereguleerd eiwit 75 (GRP75) in GC onderzoeken. Hier toonden onze gegevens aan dat in vergelijking met SGC7901-cellen de expressie van GRP75 aanzienlijk hoger was in cisplatine-resistentie (cellen (SGC7901 *). Knockdown van GRP75 maakte een einde aan het behoud van de mitochondriale membraanpotentiaal (MP) en remde de nucleaire factor erytroïde{{ 10}}gerelateerde factor 2 (NRF2), fosfatidylinositol 3-kinase/proteïnekinase B (Pl3K/AKT), hypoxie-induceerbare factor 1a (HIF-1a) en c-myc, wat resulteerde in het blokkeren van de activering van Deze processen verzwakten de anti-oxidatie/apoptose-capaciteiten en veranderden de metabole herprogrammering in SGC7901 "-cellen, wat leidde tot het opnieuw sensibiliseren van deze cellen voor cisplatine. Overexpressie van GRP75 in SGC7901-cellen veroorzaakte echter het tegenovergestelde effect. Een xenografts-model bevestigde de bovengenoemde resultaten. Bij GC-patiënten die platinachemotherapie en een meta-analyse kregen, was een hoog niveau van GRP75 positief geassocieerd met agressieve kenmerken en een slechte prognose, inclusief maar niet beperkt tot gastr o-intestinale kankers, en was een onafhankelijke voorspeller voor de totale overleving. Gezamenlijk gaf onze studie aan dat GRP75 betrokken was bij de cisplatine-resistentie van GC en dat GRP75 een potentieel therapeutisch doelwit zou kunnen zijn voor het herstellen van de geneesmiddelrespons in platina-resistente cellen en een nuttig additief prognostisch hulpmiddel bij het begeleiden van klinische behandeling van GC-patiënten.

Klik hier om meer te weten

Invoering

Maagkanker (GC) was de eerste belangrijkste incidentie en tweede belangrijkste mortaliteit van kankers in het spijsverteringsstelsel in China. De huidige behandelingen voor gevorderde GC waren de chirurgische ingreep gecombineerd met systemische chemotherapie, maar het overlevingspercentage op lange termijn was minder dan bevredigend vanwege het hoge postoperatieve recidief2. In de klinische praktijk waren platinamedicijnen een van de eerstelijns middelen voor gevorderde GC-chemotherapie3. Verworven resistentie tegen geneesmiddelen trad echter altijd op na meerdere cycli van op platina gebaseerde behandeling en duidt op een slechte prognose.cistanchDaarom was het dringend essentieel om de potentiële mechanismen te belichten en de nieuwe therapeutische strategieën te identificeren om resistentie tegen platinageneesmiddelen bij GC-patiënten te overwinnen.

Cistanche kan anti-aging

Glucose-gereguleerd eiwit 75 (GRP75) was de stress-induceerbare moleculaire chaperonne die behoorde tot de familie van hitteschokeiwitten4. Overexpressie van GRP75 was nauw geassocieerd met tumorprogressie bij verschillende vormen van kanker bij de mens5-7. Hier hebben we, via het verkennen van een meta-analyse, gevonden dat een hoog niveau van GRP75 een significant slechte prognose aangaf bij verschillende kankers van het spijsverteringsstelsel (darmkanker, cholangiocarcinoom en pancreaskanker). Voor geneesmiddelresistentie keerde remming van GRP75 de resistentie tegen cisplatine en doxorubicine bij hepatocellulair carcinoom en eierstokkanker om ". GRP75 sekwestreerde klassiek de p53 in het cytoplasma, wat leidde tot de inactivatie van de p53-functie en het onderdrukken van de app-tosis10. Een eerdere studie meldde dat GRP75 positieve tumoren hadden een slechtere prognose vergeleken met GRP75-negatieve tumoren in GC met een normale p53-functie. P53 was echter een van de meest gemuteerde genen in GC (bij meer dan 50 procent van de patiënten)l2-15. dat naast de klassieke onderdrukking van p53-activiteit, GRP75 mogelijk betrokken is bij het induceren/behouden van de resistentie tegen platinageneesmiddelen in GC via het gebruik van een ap53-onafhankelijke manier.

In deze studie droeg de hogere expressie van GRP75 bij aan cisplatineresistentie in SGC7901-cellen en in een xenotransplantaatmodel. Mechanistisch gezien induceerde / handhaafde GRP75 cisplatineresistentie door het reguleren van de anti-oxidatie / apoptotische vermogens en metabole herprogrammeringseigenschappen.cistanche AustraliëBij GC-patiënten droeg overexpressie van GRP75 bij aan de agressieve kenmerken en slechte prognose. Onze resultaten gaven aan dat GRP75 de cisplatineresistentie in GC bevorderde en een biomarker zou kunnen zijn voor het voorspellen van de respons op behandeling met platinamedicijnen.cistanche voordelenHet richten van GRP75 kan een nieuw begrip van GC systemische chemotherapie opleveren.

Resultaten

Effecten van GRP75 op cisplatineresistentie in GC Cellevensvatbaarheidstesten werden gebruikt om de resistentie van SGC7901~-cellen te verifiëren, de Ipsos (uM) van cisplatine voor SGC7901- en SGC7901CR-cellen waren: 5.518 vs.72.46 (Fig. 1A). Op basis van KM-plotter-databases duidde de verhoogde expressie van GRP75 op een slechte prognose (Fig. 1B). Bovendien verhoogden de GRP75-expressies in SGC7901CR-cellen aanzienlijk in vergelijking met de ouderlijke SGC7901-cellen (Fig. 1C), wat suggereert dat GRP75 zou kunnen bijdragen aan de cisplatine-resistentie. Om deze hypothese te verifiëren, werden SGC7901~-cellen getransfecteerd door scramble- of GRP75-siRNA, en waren de IC50's (uM) van cisplatine voor gescrambled- of GRP75-siRNA-getransfecteerde SGC7901CK-cellen: respectievelijk 50,83 vs.20.86 (Fig. 1D). In tegenstelling tot,

overexpressie van GRP75 door transfectie van de GRP75-plasmiden in SGC7901-cellen toonde aan dat de IC50's van de met cisplatine for scramble- of GRP75-plasmiden getransfecteerde SGC7901-cellen 3.825 vs.6.98 waren (Fig.1E). Gezamenlijk onthulden deze resultaten dat GRP75 een cruciale rol speelde bij het handhaven / induceren van de cisplatine-resistentie in GC, maar de mechanismen bleven verder onderzoek.

Potentiële mechanismen die ten grondslag liggen aan GRP75 veroorzaakten resistentie tegen cisplatine

We hebben microarray-datasets GSE122130 (SGC7901CR vs. SGC7901) en GSE14209 (weefsels, cisplatine-resistent vs. cisplatine-gevoelig) gedownload van GEO, vervolgens hebben we het GO-biologische proces en KEGG-Pathway-verrijkingsanalyse uitgevoerd op basis van DAVID, en de top 10 resultaten werden getoond in Fig.2A-D. De essentiële verschillen van biologische processen tussen SGC7901C*-cellen en SGC7901-cellen omvatten oxidatiereductie, apoptotisch proces (Fig. 2A), KEGG-Pathway-verrijkingsanalyse wees uit dat DEGs-sets nauw gecorreleerd waren met metabole routes, en fosfatidylinositol 3-kinase/proteïnekinase B (PI3K/AKT) pad (Fig. 2B). Reactie op het medicijn was opgenomen in de essentiële verschillen van biologische processen tussen cisplatine-resistente en cisplatine-gevoelige tumorweefsels en de metabole route was ook de kernlink in KEGG-Pathway-verrijkingsanalyse (Fig. 2C, D). Bovendien werd een netwerk van 60 eiwitten die significant interageerden met GRP75 geconstrueerd met behulp van de String-database, waarna KEGG-Pathway-analyse werd uitgevoerd dat metabole routes een belangrijke rol speelden tussen GRP75 en zijn interactoren (Fig. 2E). Op basis van deze resultaten vermoedden we dat anti-oxidatie/apoptose en metabole herprogrammering de overleving en groei van GC zouden kunnen bevorderen, wat leidt tot cisplatine-resistentie. De mechanismen van GRP75-deelname aan regulering moesten echter verder worden onderzocht (Fig. 2F).

Effecten van GRP75 op anti-oxidatie en anti-apoptose Hier was het intracellulaire ROS-niveau verhoogd in SGC7901CR-cellen in vergelijking met zijn ouderlijke tegenhangers (Fig. 3A), wat suggereert dat SGC7901Ck-cellen werden blootgesteld aan relatief hogere oxidatieve stress-omstandigheden. Een eerdere studie onthulde dat GRP75 betrokken was bij de stabilisatie van MMP, een belangrijke bron van ROS-generatie. Hier schafte knockdown van GRP75 het behoud van MMP in SGC7901CK-cellen geïnduceerd door cisplatine af, en overexpressie van GRP75 had het tegenovergestelde effect in SGC7901-cellen (Fig. 3B).cistanche cholesterolVervolgens hebben we de relatie tussen GRP75 en anti-oxidatie en anti-apoptose gevalideerd. Zoals getoond in Fig. 3C, verlaagde knockdown van GRP75 het niveau van nucleaire factor erytroïde -2-gerelateerde factor 2 (NRF2) en zijn stroomafwaartse doelgenen (HO-1 en NQO-1) in SGC7901 ~ cellen en overexpressie van GRP75 vertoonden het tegenovergestelde effect in SGC7901-cellen. Bovendien verbeterde de knockdown van GRP75 of NRF2 in SGC7901CR-cellen de intracellulaire ROS-generaties, apoptose (Fig. 3D) en caspase -3-activiteiten (aanvullend Fig. S1) geïnduceerd door cisplatine. Daarentegen verzwakte overexpressie van GRP75 in SGC7901-cellen significant de door cisplatine geïnduceerde ROS-generaties, celapoptose (Fig. 3E) en caspase -3-activiteiten (aanvullend Fig. S1). Deze resultaten onthulden dat GRP75 resistentie tegen cisplatine zou kunnen behouden/geïnduceerd via het induceren van anti-oxidatie en anti-apoptose in GC-cellen.

Effecten van GRP75 op metabole herprogrammering Vervolgens hebben we verder onderzocht hoe GRP75 verandering van metabole herprogrammering induceerde. Toenemend bewijs toonde aan dat het metabolisme van tumorcellen geen abnormale verandering in een enkele metabole route was, maar een herprogrammering van het gehele cellulaire metabolische netwerkl7. Veel klassieke oncogenen of signaalroutes waren direct of indirect betrokken bij metabole herprogrammering, zoals PI3K/AKT, hypoxia-inducible factor la (HIF-la), c-myc, enzovoort"'819. Daarom hebben we geverifieerd of GRP75 betrokken bij de metabole herprogrammering van GC-cellen Zoals getoond in figuur 4A, observeerden we verhoogde p-AKT-, HIF-la- en c-myc-niveaus in SGC7901CR-cellen vergeleken met de ouderlijke SGC7901-cellen Bovendien, in SGC7901CR-cellen, knockdown van GRP75 verlaagde de door cisplatine geïnduceerde p-AKT-, HIF-la- en c-Myc-eiwitniveaus en hun stroomafwaartse doelen gerelateerd aan glycolyse (HK2: hexokinase 2; PDK1: pyruvaatdehydrogenasekinase l; en LDHA: lactaatdehydrogenase A-keten). Integendeel, overexpressie van GRP75 in SGC7901-cellen vertoonde het tegenovergestelde effect (Fig. 4B, C). Verder vertoonde knockdown van GRP75 of AKT in SGC7901CR-cellen een significante afname in glucoseopname en cellevensvatbaarheid/groei geïnduceerd door cisplatine; overexpressie van GRP75 in SGC7901-cellen aanzienlijk verhoogde het vermogen tot glucoseopname en cellevensvatbaarheid/groei veroorzaakt door cisplatine (Fig. 4D-F). Gezamenlijk gaven deze gegevens aan dat GRP75 de resistentie tegen cisplatine in GC-cellen handhaafde/geïnduceerde zou kunnen zijn via deelname aan p-AKT-, HIF-la- en c-myc-gemedieerde metabole herprogrammering.

Bevestiging van de in vitro gegevens in een xenotransplantaatmodel Vervolgens hebben we de potentiële klinische relevantie van GRP75 in vivo onderzocht. De xenotransplantaatgegevens gaven aan dat behandeling met alleen cisplatine of knockdown van alleen GRP75 de tumorgroei zou kunnen remmen; cisplatinebehandeling gecombineerd met GRP75-knockdown vergemakkelijkte echter significant de door cisplatine geïnduceerde remming van tumorgroei (Fig. 5A). Bovendien toonden IHC- en qPCR-assays aan dat cisplatine plus GRP75-siRNA de expressies van Ki67, GRP75, NRF2, p-AKT en stroomafwaartse doelen significant verlaagde in vergelijking met cisplatinebehandeling alleen, maar de apoptose verhoogde (zoals bepaald door TUNEL-kleuring, Fig. 5B , C). Gezamenlijk gaven deze resultaten aan dat, door het reguleren van de anti-oxidatie/anti-apoptose vermogens en metabole herprogrammering, GRP75 de in vivo overleving en groei stimuleerde, wat op zijn beurt leidde tot cisplatine-resistentie van GC.

Identificatie van GRP75 als een kenmerkende kankerbevorderende factor en de klinische betekenis van GRP75 in GC

Vervolgens evalueerden we GRP75-expressie in opeenvolgende secties van GC-monsters. Zoals getoond in Fig. 6A, werd in vergelijking met aangrenzende niet-tumor maagweefsels een aanzienlijke verhoging van GRP75-expressie waargenomen in GC-weefsels. Overexpressie van GRP75 werd aangetoond in GC-weefsels door IHC-intensiteitsscore (Fig. 6B). Een sterkere kleuring voor GRP75 werd ook waargenomen met toenemende TNM-classificatie van het stadium van kwaadaardige tumoren (Fig. 6C, D). Vervolgens hebben we deze 116 GC-monsters in twee groepen verdeeld ("GRP75 laag" versus "GRP75 hoog", volgens de IHC-intensiteit, Fig. 6E). De transversale diameters van tumoren in de groep "GRP75 hoog" waren significant groter dan die in de groep "GRP75 laag" (Fig. 6F). We hebben de klinische prognose van GRP75 in GC verder gevalideerd. Kaplan-Meier-overlevingsanalyse toonde ook aan dat GC-patiënten in de "GRP75 high" -groep een slechtere algehele overleving hadden dan die in de "GRP75 low" -groep (Fig. 6G).

Multivariate analyse identificeerde dat GRP75 een onafhankelijke voorspeller was voor algehele overleving (tabel 1).cistanche deserticola bijwerkingen,Samengevat suggereerden deze resultaten dat GRP75 een karakteristieke rol speelde bij het leiden van GC-progressie, cisplatineresistentie en slechte prognose. Meta-analyse van het hoge niveau van GRP75 met de prognose Stroomdiagram van literatuuronderzoek en -selectie en meta-analyse werden getoond in aanvullende figuur S2. Het random-effect-model en het fixed-effect-model werden gebruikt om de HR-waarde te berekenen en te analyseren. Beide toonden aan dat hoge niveaus van GRP75 significant geassocieerd zijn met slechte patiëntresultaten. De gepoolde HR was 1,91 (95 procent CI 1,62 tot 2,25), met heterogeniteit (I'=0.0 procent, p =0,559) (Fig. 7A). Vervolgens hebben we een subgroepanalyse gemaakt, waaruit bleek dat het expressieniveau van GRP75 bij maagdarmkanker (gepoolde HR was 1,99,95 procent CI 1,64 tot 2,43), een significante relatie heeft met een slechte overlevingsprognose. Zeker, vergelijkbare resultaten werden ook gevonden in andere tumoren (gepoolde HR was 1,74,95 procent CI 1,29 tot 2,33) (Fig.7B). Beide

Begg's trechterplot en Egger's test werden gebruikt om de mogelijke publicatiebias van de opgenomen onderzoeken te beoordelen. Bij de analyse van de associatie tussen GRP75 en OS was de p-waarde van Begg's test en Egger's test respectievelijk 0.076 en 0,024 (Fig. 7C en D). De test van Egger heeft echter een hogere gevoeligheid bij het evalueren van publicatiebias. Daarom werd de trim- en vulmethode gebruikt om onze resultaten geloofwaardiger te maken. Zoals weergegeven in Fig. 7E, was de aangepaste HR in het fixed-effect-model 1,785 (95 procent BI 1,530 tot 2,081, p.<0.001), and="" in="" the="" random="" effect="" model="" was="" 1.792="" (95%="" ci="" 1.515="" to=""><0.001), which="" was="" not="" significantly="" different="" from="" overall="" hr.="" in="" our="" analysis,="" a="" high="" level="" of="" grp75="" showed="" a="" poor="" prognosis="" including="" but="" not="" limited="" to="" gastrointestinal="" cancer,="" which="" was="" highly="" consistent="" with="" our="">

Discussie

In deze studie gebruikten we een van de eerstelijns chemotherapeutica voor patiënten met GC, platinamedicijnen. Klassiek zouden platinamedicijnen covalent kunnen binden aan guanine op de DNA-keten en zo de replicatie en transcriptie van DNA2 blokkeren. Vanwege resistentie tegen geneesmiddelen en ongewenste bijwerkingen was het echter dringend essentieel om nieuwe therapeutische strategieën te identificeren om resistentie bij GC-patiënten om te keren. Bovendien ontwikkelden GC-patiënten resistentie tegen geneesmiddelen na het ontvangen van verschillende kuren met cisplatine, en onze resultaten toonden aan dat SGC7901-cellen significante resistentie tegen cisplatine vertoonden in vergelijking met SGC7901-cellen.

GRP75 (mortalin/mot-2/HSPA9) speelde een sleutelrol bij het reguleren van het ontstaan ​​en de progressie van kanker bij de mens-7. Meer recentelijk was het duidelijk geworden dat GRP75 ook een cruciale rol speelde bij resistentie tegen chemotherapie ". Naast GRP75 speelden andere heat shock-eiwitten een cruciale rol bij cisplatineresistentie via PI3K/AKT/NF-KB en andere routes21-24 Het moleculaire mechanisme van GRP75 en cisplatineresistentie werd echter zelden gerapporteerd. Hier onthulde onze studie dat GRP75 anti-oxidatie/apoptose vermogens bevorderde en veranderde metabolische herprogrammering, wat leidde tot cisplatineresistentie in GC-cellen. We ontdekten ook dat GRP75 werd opgereguleerd in SGC7901~-cellen en in weefselmonsters van patiënten, en was gecorreleerd met resistentie tegen geneesmiddelen, pro-overleving, groei en slechte resultaten. Ondertussen identificeerde multivariate analyse dat GRP75 een onafhankelijke voorspeller was voor algehele overleving. Bovendien gaf meta-analyse aan dat een hoog niveau van GRP75 vertoonde een slechte prognose, inclusief maar niet beperkt tot GC, wat zeer consistent was met ons onderzoek. Alle bovenstaande resultaten bevestigden dat het richten op GRP75 kon naar verwachting een nieuwe benadering worden om de cisplatineresistentie om te keren en de prognose van GC-patiënten te verbeteren.

Onder fysiologische omstandigheden werden cellen onvermijdelijk blootgesteld aan ROS door externe factoren en intracellulair aëroob metabolisme. Als een tweesnijdend zwaard waren geschikte ROS belangrijke signaalmoleculen die de normale functie van cellen reguleren, terwijl overmatige ROS tot apoptose leidde. Daarom bestond er in het lichaam een ​​nauwkeurig antioxidantregulatiesysteem om de redoxbalans en apoptotische procedures te handhaven 20. In tegenstelling tot fysiologische omstandigheden waren de ROS-niveaus van tumoren echter over het algemeen significant hoger dan normale controles van dezelfde weefseloorsprong, wat het bestaan ​​van een speciale anti-oxidantsysteem in tumorcellen, vooral voor geneesmiddelresistente tumorcellen27-29. Onze resultaten bevestigden dat SGC7901CR-cellen een relatief hoger niveau van ROS vertoonden in vergelijking met SGC7901-cellen en dat GRP75 de capaciteiten van anti-oxidatie/apoptose verhoogde. Tumorcellen hadden een lange geschiedenis van metabole afwijkingen. Al in de jaren dertig ontdekte Otto Warburg dat tumorcellen de voorkeur geven aan glycolyse. Zelfs onder zuurstof-voldoende omstandigheden handhaafden tumorcellen nog steeds hoge glycolysesnelheden voor ATP-generatie. Dit abnormale metabolische patroon werd het "Warburg-effect"3031 genoemd. De door het Warburg-effect geleide metabole veranderingen werden onlangs metabolische herprogrammering genoemd, en studies van deze veranderingen verschaften een dieper begrip van het GC-celmetabolisme. Er was aangetoond dat GC-cellen en normale cellen metabolische verschillen vertoonden, niet alleen in het glucosemetabolisme, maar ook in het metabolisme van lipiden en aminozuren³2-35. In dit onderzoek ontdekten we dat veranderingen in het glucosemetabolisme een van de belangrijkste links die de celgroei in stand houden, wat uiteindelijk leidt tot GC-cisplatineresistentie.

Zoals we al zeiden, waren klassieke oncogenen en signaalroutes zoals PI3K/AKT, HIF-la en c-myc direct of indirect betrokken bij metabole herprogrammering. Activering van de PI3K/AKT-route in tumorcellen versterkte veel van de metabolische activiteiten. Ten eerste stond het cellen toe om glucose, aminozuren en andere voedingsstoffen op te nemen. Ten tweede verhoogde AKT de glycolyse en lactaatproductie via zijn effecten op genexpressie en enzymactiviteit en was het voldoende om een ​​War-burg-effect in kankercellen te induceren. Ten derde versterkte activering van dit pad de biosynthese van macromoleculen en stimuleerde het de expressie van lipogene genen en lipidesynthese'7. Bovendien remden GRP75-geactiveerde AKT en extracellulaire signaal-gereguleerde proteïnekinasen 1 en 2 Bax-conformatieveranderingen en apoptose 8. Tumorcellen aangepast aan hypoxie met metabole herprogrammering via opregulatie van HIF-la-doelgenen om glucoseopname, glycolyse, productie en afscheiding van melkzuur, glycogeenopslag, glutamine-katabolisme³ en bevordering van de accumulatie van triglyceriden in lipidedruppeltjes³. Meer recentelijk was het duidelijk geworden dat GRP75 specifiek aan HIF-la kon binden en zich zou kunnen richten op het buitenste mitochondriale membraan, geassocieerd met VDAC1 en HK2, die apoptose voorkwamen'. C-myc kon metabolische herprogrammering op een aantal manieren bemiddelen, en c-myc-gemedieerde metabole herprogrammering werd grotendeels bereikt door mitochondriën te beïnvloeden. Aan de ene kant bevorderde c-myc ook de glycolyse door de expressie van glycolytisch gerelateerde enzymen, waaronder LDHA, HK2 en PDK11938, direct te reguleren. Aan de andere kant bevorderden door c-myc geactiveerde enzymen die betrokken zijn bij het glutaminemetabolisme via transcriptie het gebruik van glutamine door mitochondriën in tumorcellen. Dit effect wordt "glutaminolyse" genoemd. Bovendien verminderde GRP75-overexpressie Cyclin-B1 en reguleerde het Cyclin-D1 en c-myc om de groei van eierstokkankercellen te bevorderen*. Op basis van onze huidige resultaten hebben we een nieuw begrip van GC-cisplatineresistentie verschaft via GRP75 als een potentieel belangrijke schakel in de regulatie van metabole herprogrammeringsnetwerken van tumoren.

conclusies

Concluderend hebben we aangetoond dat overexpressie van GRP75 overleving/groei in GC-cellen zou kunnen bevorderen door anti-oxidatie/apoptose en metabole herprogrammeringsnetwerken te reguleren, waardoor cisplatine-resistentie wordt geïnduceerd.

materialen en methodes

Cellen, reagentia en kweekomstandigheden

GC cell lines, SGC7901 cells (mutant-type of p53), and cisplatin-resistance cells (SGC7901CB) were obtained from and STR identified by KeyGENE Bio Co. Ltd (Nanjing, China). Cisplatin(Pt(NH3)2Clz, >99.0 procent zuiverheid), werd gekocht bij Sigma-Aldrich (Shanghai, China). Cellen werden gekweekt in RPMI-1640medium (Gibco, Grand Island, NY, VS), aangevuld met 10 procent foetaal runderserum （FBS）, 100 E/ml penicilline, 100 ug/ml streptomycine (Gibco) en geïncubeerd in 5 procent CO2 bij 37 graden. Voor handhaving van het cisplatine-resistentie-fenotype werden SGC7901CR-cellen geïncubeerd in een medium dat cisplatine （5μM） bevatte.

Xenotransplantaten en behandelingen

Deze studie werd goedgekeurd door Nanjing Medical University Institutional Animal Care and Use Committee, en dieren werden humaan behandeld en met betrekking tot de verlichting van lijden. De naakte BALB / c-muizen werden verkregen van SLRC Laboratory Animal Center (Shanghai, China) en werden conventioneel gehouden zoals we eerder beschreven * l. Voor de xenotransplantaatstudie werden 2 x 10 graden SGC7901CK-cellen in 100 ul matrigel gedurende 5 weken subcutaan in de flanken van de muizen geïnjecteerd. Om de effecten van GRP75 op de cisplatineresistentie van GC te bepalen, hebben we de intratumorale en intraperitoneale injectietest uitgevoerd. In het kort werden muizen willekeurig verdeeld in 4 groepen (5 muizen per groep): (1) MOCK, (2) GRP75KD, (3) MOCK-cisplatine en （4） GRP75 KD-cisplatine. 100 µl siRNA si-Con of si-GRP75, 100 nM) waren om de 3 dagen intratumorale injecties. De groepen die werden behandeld met cisplatine (5 mg/kg) kregen driemaal per week intraperitoneale injecties en de andere groepen kregen een gelijk volume zoutoplossing toegediend. Tumoren werden wekelijks gemeten en hun volumes werden berekend met de formule: V=Y (breedte2 lengte). Na 5 weken werden de muizen opgeofferd en werden tumorweefsels verwijderd voor verder onderzoek.

Patiënten en weefselmonsters

Deze studie werd goedgekeurd door de Medical Ethics Committee van het Second Affiliated Hospital, Nanjing Medical University en het Affiliated Changzhou No. 2 Hospital van de Nanjing Medical University en de schriftelijke geïnformeerde toestemming van de deelnemer werd verkregen van elke patiënt. De klinisch-pathologische gegevens werden vermeld in aanvullende tabel S1. De weefselmicroarray werd geconstrueerd door Zhuoli Biotechnology Co.Ltd (Shanghai, China) zoals we eerder beschreven*

celtransfectie

Voor transfectie werden scrambled en pcDNA-3.1-GRP75-Flag gesynthetiseerd door General Biotech (Shanghai, China); terwijl siRNA's werden vermeld in aanvullende tabel S2. Cellen werden tijdelijk getransfecteerd via lipofectamine 3000-reagens (Invitrogen, Carlsbad, VS), volgens het protocol van de fabrikant. In het kort werden cellen uitgeplaat op 6-putjesplaten met een dichtheid van 1 x 10 graden cellen in RPMI 1640-medium dat 10% FBS bevat zonder antibiotica. Na 24 uur incubatie werden de cellen tijdelijk getransfecteerd met 5 ng/ml vervormd of GRP75-Flag, of 20 nM si-Con of si-GRP75 gedurende 12 uur. Na transfectie werden de cellen nog 24 uur gekweekt in een vers medium aangevuld met 10% FBS voordat ze voor andere experimenten werden gebruikt.

Kwantitatieve real-time polymerasekettingreactie (qPCR) De gebruikte primers werden vermeld in aanvullende tabel S3. De isolatie van totaal RNA, de transcriptie van RNA naar cDNA en de prestaties van qRT-PCR met Applied Biosystems 7300HT-machine waren allemaal volgens onze eerdere studie 2. De -actine werd geamplificeerd om de cDNA-integriteit te waarborgen en de expressie te normaliseren. Vouwveranderingen in expressie van elk gen werden berekend met een vergelijkende drempelcyclus (Ct)-methode met behulp van de formule 2-(4ACt)

Dit artikel is overgenomen uit Dai et al. Celdood ontdekking (2021) 7:140 https://doi.org/10.1038/s41420-021-00517-w