Immuunreacties op sequentiële binoculaire transplantatie van allogene retinale voorlopercellen naar de glasvochtholte bij muizen

Abstract:

Intravitreale transplantatie van allogene menselijke retinale voorlopercellen (RPC) is veelbelovend als behandeling voor verblindende retinale degeneratie. Eerder onderzoek heeft aangetoond dat neurale voorlopercellen goed worden verdragen als allotransplantaten na enkele injecties; de opeenvolgende afgifte van allogene cellen verhoogt echter het potentiële risico van sensibilisatie van de gastheer met daaropvolgende immuunafstoting van transplantaten. De huidige studie was bedoeld om te beoordelen of een immuunrespons zou worden geïnduceerd door herhaalde intravitreale transplantaties van allogene RPC's met behulp van het muisdiermodel. We injecteerden muriene retinale voorlopercellen (gmRPC's), oorspronkelijk afkomstig van donoren met een genetische achtergrond van C57BL/6, in BALB/c-ontvangermuizen om veiligheidsgegevens te verschaffen over wat kan worden verwacht na herhaalde behandeling van patiënten met een allogeen menselijk celproduct . De immuunreacties op gmRPC's waren mild en bestonden uit T-cellen, B-cellen, neutrofielen en natural killer-cellen, waarbij macrofagen duidelijk de overhand hadden. Dieren behandeld met herhaalde doses gmRPC's vertoonden geen bewijs van sensibilisatie, noch was er sprake van immuungemedieerde vernietiging van de transplantaten. Ondanks de afwezigheid van immunosuppressieve behandelingen overleefden allogene gmRPC-transplantaten na herhaalde dosering, wat ondersteuning biedt voor de voorlopige observatie dat herhaalde injectie van allogene RPC's in de glasvochtholte wordt getolereerd bij patiënten met retinitis pigmentosa.

cistanche plantverhogend immuunsysteem

Klik hier om de producten van Cistanche Enhance Immunity te bekijken

【Vraag om meer】 E-mail:cindy.xue@wecistanche.com / Whats-app: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

Trefwoorden: stamcellen; immuuntolerantie; immuun voorrecht; afstoting van transplantaten; intravitreale injectie

1. Inleiding

Retinitis pigmentosa (RP) omvat een klasse van genetische staaf-kegeldegeneratie en resulteert in progressieve visuele beperking en uiteindelijk blindheid. Voor de overgrote meerderheid van de gevallen zijn er geen bewezen therapeutische maatregelen beschikbaar om het gezichtsvermogen te behouden of te herstellen; Eén strategie om aan deze onvervulde medische behoefte tegemoet te komen is echter stamceltransplantatie. Onze onderzoeksgroep heeft intravitreale injectie van gekweekte menselijke retinale voorlopercellen (RPC) onderzocht als een manier om in te grijpen bij RP met als therapeutisch doel de progressie te stabiliseren of misschien het verloop van de ziekte om te keren. RPG's kunnen worden afgeleid van onrijpe netvliezen via weefseldonatie of, meer recentelijk, van pluripotente cellijnen. Studies in diermodellen hebben aangetoond dat deze cellen in staat zijn fotoreceptoren te redden van degeneratie na injectie in het oog en ook in staat zijn te differentiëren tot staaffotoreceptoren in het gastoog. Er zijn aanwijzingen uit dierstudies dat geïnjecteerde hRPC's functionele, geïntegreerde fotoreceptoren kunnen worden en daardoor mogelijk het netvlies kunnen stabiliseren door stervende cellen direct te vervangen. Geïnjecteerde hRPC's zouden RP dus zowel op een neurotrofe manier als via een celvervangingsmechanisme kunnen behandelen. Hoe dan ook, deze celgebaseerde aanpak biedt een rationele strategie voor de behandeling van patiënten die lijden aan RP en mogelijk ook aan andere netvliesziekten.

Een ander gunstig kenmerk van RPC's, en misschien van neurale voorlopers in het algemeen, is de relatieve tolerantie die deze cellen krijgen na transplantatie als allotransplantaten, vooral wanneer ze worden afgeleverd op een locatie die immuunprivileges vertoont, zoals het netvlies [1,2]. Dat gezegd hebbende, blijven recente overzichten van klinische onderzoeken die zijn uitgevoerd op het gebied van de regeneratieve geneeskunde melding maken van wijdverspreide en significante uitdagingen die verband houden met ontstekingen en afstoting van het immuunsysteem [3,4], ook voor interventies die op het oog zijn gericht, zoals retinale gentherapieën [5], zoals evenals sommige maar niet alle celtherapieën [6]. Hoewel het een lokaal celtype is, is de retinale pigmentepitheelcel (RPE) niet vrijgesteld van afstotingsproblemen [7-9]; daarom is immuunsuppressie van ontvangers momenteel de standaardpraktijk [10,11]. Menselijke RPC's lijken daarentegen opmerkelijk goed te worden verdragen als allotransplantaten [6,12-16], hoewel dit zich niet uitstrekt tot hun gebruik als xenotransplantaten, waarbij immuunsuppressie vereist is [17]. De basis voor duurzame overleving van allogene RPC's in het oog omvat waarschijnlijk een aantal factoren die verband houden met de gebruikte cellen en de ontvangende plaats [1,8,18,19]. In eerder werk met behulp van flowcytometrie hebben we aangetoond dat menselijke neurale voorlopercellen, zowel afkomstig van de hersenen als van het netvlies, klasse I, maar niet klasse II, belangrijke histocompatibiliteit (MHC) antigenen tot expressie brengen [20,21]. Het klassieke mechanisme van transplantaatafstoting omvat de niet-specifieke herkenning van vreemde MHC klasse II-moleculen door CD4+ gastheerlymfocyten [20–25]. Op die manier zou een afwezigheid van klasse II-moleculen het mogelijk kunnen maken dat geënte voorlopercellen de immuunafstoting die via dit mechanisme wordt gemedieerd, omzeilen. De schijnbare ‘immuunbevoorrechte’ status van intravitreaal geïnjecteerde hRPC’s is echter niet noodzakelijkerwijs absoluut. Hoewel de voorlopercellen van het centraal zenuwstelsel (CZS) van muizen bij aanvang geen detecteerbare klasse I- of klasse II-MHC-moleculen tot expressie brengen en schijnbaar immuunprivilege vertonen als allotransplantaten [1,2,20], kunnen deze cellen onder bepaalde omstandigheden immuunafstoting ondergaan. Studies hebben aangetoond dat MHC-antigenen kunnen worden geïnduceerd door de stimulatie van CZS-voorlopercellen met interferon-gamma (IFN) [1,26]. CZS-voorlopercellen kunnen worden afgewezen na sensibilisatie van een eerder geënte gastheer. Daarom brengen CZS-voorlopercellen (inclusief RPC's) alloantigenen tot expressie die worden gedetecteerd door het immuunsysteem van de gastheer. Samen impliceert dit dat de immuunbevoorrechte status van getransplanteerde voorlopercellen voorlopig is en onderhevig is aan modulatie, bijvoorbeeld door cytokinen die aanwezig zijn in de lokale micro-omgeving, en die veranderingen kunnen ondergaan tijdens het verloop van degeneraties zoals RP. Om al deze redenen is de immuunrespons op meerdere intravitreale RPC-injecties moeilijk te voorspellen en moet deze specifiek worden onderzocht.

cistanche tubulosa-verbetering van het immuunsysteem

Als RPC-behandeling klinisch succesvol blijkt te zijn bij RP, zullen er sterke prikkels zijn voor de behandeling van beide ogen bij deze bilaterale verblindende ziekte. Op zijn minst om veiligheidsredenen zouden binoculaire behandelingen doorgaans opeenvolgend worden uitgevoerd, met een aanzienlijke vertraging tussen de twee injecties. Merk op dat deze opeenvolgende afgifte van allogene cellen kan resulteren in sensibilisatie van de gastheer als reactie op de eerste injectie, wat mogelijk immuunafstoting kan veroorzaken als reactie op de tweede injectie. Dit kan resulteren in het verlies van transplantaten in beide ogen. Eerdere rapporten waarin enkelvoudige subretinale doseringen met hRPC's in RP [27] of herdosering met menselijke neurale voorlopercellen bij dieren [28,29] werden onderzocht, omvatten immuunsuppressie. Daarom werd de volgende studie ontworpen als een translationeel onderzoek van RPC's van muizen als sequentiële allotransplantaten in een immuuncompetente muizenstam met een ongelijksoortige genetische achtergrond. Hoewel dit werk geen betrekking heeft op menselijke RPC-producten, werd dit werk uitgevoerd als onderdeel van onderzoeken die IND mogelijk maken om diergegevens te verschaffen over de veiligheid, dwz of immuunsuppressie nodig zou zijn voor patiënten die herhaalde RPC-allotransplantaatbehandelingen kregen in door de FDA geregistreerde onderzoeken.

2. Resultaten

Om de immunologische gevolgen van bilaterale RPC-injectie bij allogene muizen te bestuderen, werden gmRPC's (C57BL/6 genetische achtergrond) intravitreaal geïnjecteerd in één oog van BALB/c-ontvangers en een tweede dosis RPC's werd 2 weken later in het andere oog geïnjecteerd. Het tijdsinterval van 2-week werd zo gekozen dat het voldoende was om het eerste transplantaat in staat te stellen zowel aangeboren als adaptieve immuunreacties te induceren. Geen van de proefdieren ontving enige immuunonderdrukkende medicijnbehandeling, zodat de natuurlijke fysiologische immuunreacties konden worden waargenomen.

2.1.Klinische observatie en oogheelkundig onderzoek brachten geen afwijkingen aan het licht

De gewichten van proefdieren werden gemeten op het moment van elke gmRPC-injectie. Alle proefdieren vertoonden gewichtstoename tussen de eerste en de tweede injectie, wat consistent is met een over het algemeen goede gezondheid. Dieren die op dag 14 en dag 28 ± 1 na de tweede gmRPC-injectie waren beëindigd, werden door de chirurgische microscoop onderzocht. Zowel de voorste als de achterste segmenten van de meerderheid van de onderzochte ogen werden beoordeeld als "binnen de normale grenzen" (WNL). Er waren geen tekenen van ontsteking of andere zichtbare afwijkingen bij onbehandelde, sham-behandelde en met gmRPC behandelde groepen, wat aangeeft dat intravitreale injectie met gmRPC geen ongeoorloofde ontstekingsreacties of fysieke weefselschade veroorzaakte die via deze methode detecteerbaar was. Celclusters waaruit het transplantaat bestond, waren zichtbaar in het glasvocht op zowel dag 14 als dag 28 ± 1 na de tweede gmRPC-injectie (Figuur 1). Herhaalde injectie van gmRPC's veroorzaakte geen merkbare veranderingen in de grootte van de celclusters, consistent met aanhoudende overleving van donorcellen. De grove pathologie werd ook beoordeeld op het terminale eindpunt en er werden geen vergrote oogbollen (indicatief voor tumorvorming) of andere afwijkingen opgemerkt.

Figuur 1. Getransplanteerde gmRPC's in vivo gevisualiseerd via fundusfotografie door een chirurgische microscoop (allemaal=linkeroog, OS). (A, B), schijnbehandelde dieren (schijn/schijn, S/S); (C, D), controledieren met schijnbehandeld rechteroog gevolgd door met gmRPC's behandeld linkeroog (schijn/cel, S/C) en dieren met beide ogen achtereenvolgens behandeld met gmRPC's (cel/cel, C/C) werden geobserveerd en afgebeeld door de chirurgische microscoop. Het bovenste paneel (A, C, E) toont beelden van OS genomen op dag 14 na de tweede injectie; het onderste paneel (B, D, F) toont beelden van OS genomen op dag 28 na de tweede injectie. Allotransplantaten werden gezien als lichtgekleurde celklonten (pijlen) zichtbaar in het glasvocht van met cellen geïnjecteerde linkerogen (S/C, C/C) op beide tijdstippen (dag 14: (C, D); en dag 28: ( E, F)). Afgezien van de transplantaten was er geen duidelijke ontsteking of aanvullende afwijking te zien in de voorste en achterste segmenten, zoals op deze manier axiaal bekeken.

2.2. Immunofluorescente labeling toonde immuuncellen in het glasvocht

Immunofluorescente labeling voor vijf belangrijke immuunceltypen (macrofagen, neutrofielen, natuurlijke killercellen, T-cellen en B-cellen) werd uitgevoerd op de oculaire cryosecties en onthulde positieve immuuncelinfiltratie in het oog na gmRPC-injectie (Figuur 2A – F). T-cellen (CD3), B-cellen (CD45R), neutrofielen (Ly-6G) en natuurlijke killercellen (CD49b) vertoonden een beperkte aanwezigheid in ogen geïnjecteerd met gmRPC's, terwijl geactiveerde macrofagen (Iba-1 ) waren de belangrijkste immuuncellen die reageerden op de intravitreale transplantaten. Vergelijkbaar weefsel van onbehandelde en schijnbehandelde dieren vertoonde geen immuuncellen in oculaire cryosecties, wat erop wijst dat de waargenomen infiltratie van immuuncellen een reactie was op de gmRPC-transplantaten. In overeenstemming met deze waarneming bevonden de immuuncellen zich in het gebied rondom de gmRPC-transplantaten of binnen de gmRPC-clusters zelf.

Figuur 2. Immunolabeling van geïnfiltreerde immuuncellen per behandelingsgroep. Immunofluorescente beelden van (A) controlesecties (alleen secundair antilichaam), (B) anti-Iba-1 (geactiveerde macrofaag- en microglia-marker), (C) anti-Ly-6G (neutrofielenmarker), (D) anti-CD49b (natural killer-celmarker), (E) antilichamen anti-CD3 (T-celmarker) en (F) anti-CD45R (B-celmarker) worden weergegeven in de figuur. De beperkte aanwezige rode signalen duiden op positieve antilichaamlabeling voor leukocytmarkers, groene signalen duiden op de gmRPC-transplantaten en blauwe signalen duiden op DAPI-nucleaire labeling. Geel is een niet-specifieke overlap van signalen, het duidelijkst in de buitenste segmenten van de fotoreceptor die autofluorescentie vertonen. Behandelgroepen: onbehandeld (UT), beide ogen onbehandeld; S/S, beide ogen schijnbehandeld (opeenvolgend) met voertuig; S/C, rechteroog geïnjecteerd met voertuig gevolgd door linkeroog met 50,000 gmRPC's en; C/C, beide ogen geïnjecteerd met 50,000 gmRPC's (opeenvolgend) volgens schema in sectie 4

De piekaantallen van elke immuuncel in het oog varieerden per celtype (Figuur 3A – E). Daarentegen onthulde tweeweg-ANOVA geen verschillen in de infiltratie van immuuncellen bij het vergelijken van dieren die enkele gmRPC-injecties ontvingen (schijn/cellen) met dieren die bilaterale injecties ontvingen (cellen/cellen). Dit was het geval voor infiltratie van macrofagen (anti-Iba-1-kleuring) (Figuur 3A), neutrofielen (anti-Ly-6G-kleuring) (Figuur 3B), natural killer-cellen (CD49b-kleuring) ( Figuur 3C), T-cellen (CD3-kleuring) (Figuur 3D) en B-cellen (CD45R-kleuring) (Figuur 3E).

2.3. ELISPOT vertoonde geen antigeenterugroepreacties

ELISPOT is een manier om antigeenspecifieke IFN-producerende T-celactivatie te testen. Behandeling met Phorbol 12-myristaat 13-acetaat (PMA) was een positieve controle die de tweede boodschapper, DAG, nabootste om de T-celreceptorroute te activeren en op zijn beurt T-celactivering te veroorzaken. In Figuur 4A-D vertoonden met PMA behandelde groepen veel hogere aantallen IFN-vlekken vergeleken met controlegroepen met alleen reagerende cellen (dwz lymfocyten van CLN's, splenocyten van milten). Toen de respondercellen samen met C57BL/6-splenocyten (B6 SPL) werden gekweekt, waren de monsters van dag 14 vergelijkbaar met de groepen met alleen respondercellen, met slechts iets hogere IFN-spottellingen, wat wijst op een gebrek aan T-celactivatie (Figuur 4A, B).

Figuur 3. Kwantificering van de infiltratie van immuuncellen na gmRPC-transplantatie. Geïnfiltreerde immuuncellen werden gevisualiseerd als rode fluorescentiesignalen binnen het beeldveld na gmRPC-injectie voor elke experimentele toestand, geteld met behulp van ImageJ en uitgezet in staafdiagrammen. Gegevens van Iba-1 (geactiveerde macrofaag- en microglia-marker) (A), anti-Ly-6G (neutrofielen-marker) (B), anti-CD49b (natural killer-celmarker) (C), antilichamen anti-CD3 (T-celmarker) (D) en anti-CD45R (B-celmarker) (E) werden weergegeven in de figuur. Tweeweg-ANOVA-tests werden gebruikt om de significantie tussen de schijn-/cel- en cel-/celgroepen te testen; p-waarden waren: (A) p < {{10}}.4492, (B) p < 0.9376, (C) p < 0.119{{18 }}, (D) p < 0,6411 en (E) p < 0,7201 (geen enkele was significant).

Bij het testen van allogene donorcellen met behulp van deze test vertoonden de respondercellen van de dieren die intraperitoneaal waren geïnjecteerd met gmRPC's (IP-groep) geen antigeen-terugroepreacties, aangezien de monsters niet meer T-celactivatie vertoonden door IFN-spottellingen vergeleken met de schijndieren die nooit waren blootgesteld naar gmRPC's (schijn/schijn). Ook vertoonden de dieren die intravitreaal met de gmRPC's waren geïnjecteerd, hetzij één keer (schijn/cel) of herhaaldelijk (cel/cel), geen antigeen-terugroepreacties. In één geval leken de reacties op herhaalde gmRPC-dosering meer gedempt (Figuur 4B). Samen gaven deze resultaten aan dat gmRPC's een zeer lage antigeniciteit vertonen. Merk op dat C57BL/6-splenocyten werden gematcht met de genetische achtergrond van de gmRPC's. Onverwacht verhoogden de alternatieve stimulatorcellen, gmRPC's, het aantal IFN-spots in alle experimentele groepen in vergelijking met de negatieve controlegroepen (Figuur 4A – D). Een mogelijke verklaring zou kunnen zijn dat de gmRPC's een hoge achtergrond in deze test veroorzaken. Belangrijk is dat er geen verschil was tussen de onbehandelde, schijnbehandelde, enkelvoudige gmRPC-injectie en herhaalde gmRPC-injectiegroepen, wat opnieuw duidde op de afwezigheid van antigeen-recall-reacties.

Figuur 4. ELISPOT-kwantificering na gmRPC-transplantatie. ELISPOT-testen werden in de volgende groepen ingedeeld: controle, reagerende cellen alleen (lymfocyten of splenocyten die T-cellen bevatten geïsoleerd uit cervicale lymfeklieren (CLN's) of milten (SPL) van de proefdieren; PMA, reagerende cellen behandeld met phorbol {{1} }myristaat 13-acetaat (PMA) en Ca-ionofoor; B6 SPL, reagerende cellen gemengd met splenocyten geïsoleerd uit C57BL/6-dieren; gmRPC's, dezelfde reagerende cellen gemengd met gmRPC's. (A), De reagerende cellen waren de splenocyten van de proefdieren die op dag 14 na de tweede gmRPCs-injectie werden opgeofferd. (B) De respondercellen waren de lymfocyten van de CLN's van de proefdieren die op dag 14 na de tweede gmRPCs-injectie werden opgeofferd. (C) De respondercellen waren de splenocyten van de proefdieren die werden opgeofferd op dag 29 na de tweede gmRPCs-injectie. (D) De reagerende cellen waren de lymfocyten van de CLN's van de proefdieren die op dag 29 na de tweede gmRPCs-injectie werden opgeofferd. Er werden tweeweg-ANOVA-tests gebruikt om de significantie (*) tussen de schijn/cel- en cel/cel-groepen te testen; p-waarden waren: (A) p < 0.5332, (B) p < 0.0001 (significant), (C) p < 0,0207 ( significant) en (D) p <0,3355.

3. Discussie 

Er is aanzienlijke belangstelling geweest voor stamceltechnologie als middel om degeneratieve ziekten van het netvlies te behandelen en onze groep heeft het gebruik van allogene hRPC's in RP onderzocht. Om gegevens te verzamelen over mogelijke immuungevolgen wanneer meer dan één dosis allogeen menselijk RPC-product wordt toegediend via intravitreale injectie, hebben we de huidige dierstudie uitgevoerd met behulp van gmRPC's met een C57BL/6-achtergrond als transplantaten en BALB/c-muizen als gastheren. Deze ongelijksoortige genetische achtergronden werden gebruikt om sequentiële behandeling met allogene hRPC's te modelleren en voorlopige veiligheidsgegevens te verschaffen voorafgaand aan testen bij mensen.

Om de reacties volledig te evalueren, kregen de gastdieren geen enkele immunosuppressieve behandeling. We vergeleken de immuunresponsen gegenereerd door een enkele gmRPC-injectie met opeenvolgende bilaterale doseringen volgens het beschreven injectieschema. Oogheelkundig onderzoek bracht geen ontsteking of andere opmerkelijke verschillen aan het licht tussen de groepen dieren die 1 dosis gmRPC's of 2 doses gmRPC's kregen, wat erop wijst dat de ontvangers niet gesensibiliseerd waren door de initiële gmRPC-behandelingen, of dat de sensibilisatie subtiel was. Resultaten van immunolabeling onthulden dat alle vijf onderzochte immuunceltypen, namelijk T-cellen (CD3), B-cellen (CD45R), macrofagen (Iba-1), neutrofielen (Ly-6G) en natuurlijke killercellen ( CD49b), was in het oog geïnfiltreerd en had zich na de transplantatie op de RPC-transplantaten gericht. Niettemin was deze infiltratie relatief gematigd en hoewel andere celtypen detecteerbaar waren, bestond deze voornamelijk uit Iba-1 positieve macrofagen. Er was een zeer beperkt aantal T-cellen, B-cellen, neutrofielen en natuurlijke killercellen aanwezig. Interessant genoeg was de overleving die werd aangetoond door enkelvoudige en herhaalde RPC-transplantaten gelijkwaardig, zonder verlies van transplantaten in beide gevallen, ondanks de aanwezigheid van macrofagen. Over het geheel genomen suggereert dit dat zowel de aangeboren als de adaptieve immuunrespons op genetisch uiteenlopende RPC’s gematigd waren, ook al werd er geen immuunsuppressie toegepast. Bovendien vertoonden de resultaten van de ELISPOT-test geen antigeen-recall-reacties in met gmRPC behandelde groepen, consistent met de bewering dat T-cellen geen belangrijke rol spelen bij de afstoting van gmRPC-transplantaten van C57BL/6-muizen. Opnieuw werd macrofaaginfiltratie van gmRPC-transplantaten waargenomen, hoewel dit niet geassocieerd was met significante transplantaatvernietiging van het type dat geassocieerd wordt met klassieke immuunafstoting [22-24].

cistanche voordelen voor mannen versterken het immuunsysteem

Samen onthullen deze observaties een situatie die duidelijk verschilt van de algemeen erkende T- en B-cel-gemedieerde allogene transplantaatafstotingsmechanismen die in andere weefsels worden gezien. Meerdere factoren kunnen aan deze situatie bijdragen. Aan de ene kant is er het idee van het oog als een ‘immuungeprivilegieerde’ plaats, ook al is de mate waarin het glasvocht dergelijke kenmerken deelt met het hoornvlies en het netvlies minder bestudeerd en misschien meer controversieel. Aan de andere kant lijken de RPC's zelf een verminderde immunogeniciteit te vertonen als allotransplantaten, vergeleken met vaker bestudeerde celtypen. Zoals we eerder hebben aangetoond, missen RPC's bij muizen de basislijnexpressie van MHC klasse I- en klasse II-antigenen, hoewel deze induceerbaar zijn via cytokinestimulatie. Deze afwezigheid van MHC-expressie zou kunnen bijdragen aan de overleving van deze cellen na transplantatie. Niettemin ondersteunt de aanwezigheid van immuuncellen in de transplantaten het concept dat transplantaattolerantie in deze setting niet passief is en het resultaat is van een actief immuunregulerend fenomeen. Hier moet worden benadrukt dat hetzelfde soort infiltratie van immuuncellen al aanwezig was na enkele injecties en niet werd verergerd door herhaalde dosering, wat onze conclusie onderstreept dat infiltratie van immuuncellen in de transplantaten, vooral door macrofagen, niet het resultaat was van eerdere injecties. sensibilisatie van de gastheer. Binnen de parameters van dit experiment leek herhaalde dosering de algehele levensvatbaarheid van het transplantaat niet te verminderen, wat consistent was met de mogelijkheid van aanhoudende werkzaamheid in therapeutische contexten. Alternatieve parameters, zoals verschillende inter-injectie-intervallen, zouden de activiteit van de immuuncellen kunnen verhogen of verminderen in een mate die relevant zou zijn voor klinische toepassing. Of de cellulaire bestanddelen van infiltraten, inclusief de overheersing van macrofagen, ook van toepassing zouden zijn op mensen, is onduidelijk. Bovendien is de overleving van deze allograften mogelijk niet afhankelijk van een normaal netvlies met een gezonde bloed-retinale barrière. De hier gebruikte BALB/c-ontvangers zijn albino's en gevoelig voor lichte schade [30]. Bovendien is aanhoudende overleving herhaaldelijk gezien in eerder werk met verschillende retinale degeneratiemodellen (bijv. [31]).

Vergeleken met de overleving van transplantaten vormt de levensvatbaarheid van cellen in de transplantaten een complexere situatie. Er is een bekend verlies van CZS-voorlopercellen dat snel optreedt na de transplantatie, waarschijnlijk als gevolg van meerdere factoren, waaronder mogelijk abrupte terugtrekking van de groeifactor. Eenmaal gevestigd in het oog, smelten de gedissocieerde cellen samen tot bolvormige aggregaten, waarvan de centra een suboptimale micro-omgeving voor groei lijken te bieden, misschien als gevolg van het gebrek aan vascularisatie en uitdagingen voor de diffusie van voedingsstoffen. Het schijnbare tropisme van macrofagen voor de RPC-transplantaten zou een niet-specifieke reactie kunnen zijn op de aanwezigheid van deze niet-levensvatbare cellen in het inwendige van de transplantaten, waarbij de macrofagen functioneren in hun rol als wegvangers van cellulair afval. Als alternatief zouden volledig levensvatbare RPC's de macrofagen actief kunnen aantrekken, bijvoorbeeld via expressie van chemo-aantrekkelijke cytokinen, waarna de gastheercellen secundair het afval van niet-levensvatbare donorcellen zouden tegenkomen. Belangrijk is dat de mate van infiltratie van macrofagen die in deze specifieke omstandigheden wordt waargenomen geen negatieve gevolgen lijkt te hebben voor het transplantaat of het netvlies van de gastheer, in tegenstelling tot de reacties op cellulaire allograften op niet-immuunbevoorrechte plaatsen [4]. Ten slotte is het vermeldenswaard dat de hier gerapporteerde resultaten, hoewel beperkt tot een muizenmodel, implicaties kunnen hebben voor het werk bij mensen. In tegenstelling tot de muis weten we dat gekweekte menselijke RPC's bij aanvang robuuste niveaus van MHC klasse I-antigenen tot expressie brengen; daarom is de vergelijking weliswaar voorlopig. Niettemin is het interessant op te merken dat klinische testen van subretinale hRPC-transplantaten door een groep in China [13], evenals intravitreale hRPC-transplantatie door onze groep, vervolgens een aanhoudende overleving van de allografts hebben aangetoond bij niet-immuunonderdrukte patiënten met RP (JC). -01, [32], niet-gepubliceerde gegevens). Dit was ook het geval na de opeenvolgende injectie van beide ogen (JC-01 Extensie, niet-gepubliceerde gegevens), analoog aan het hier gepresenteerde werk. Bovendien werd transplantaatoverleving gezien in een vervolgonderzoek naar JC-02 [33], waarbij opeenvolgende herhaalde doses aan hetzelfde oog werden toegediend [34]. Alles bij elkaar geven deze bevindingen aan dat immuunsuppressie niet altijd noodzakelijk is in de setting van neurale voorlopercellentransplantatie, vooral voor het oog, hoewel de grenzen van dit fenomeen en de onderliggende regulerende mechanismen nog moeten worden opgehelderd.

4. Materialen en methoden

4.1. Cel cultuur

Voor deze allogene studie werden eerder gekarakteriseerde gmRPCs [31] gekozen als donorcellen. Oorspronkelijk werden gmRPC's geïsoleerd uit GFP-transgene C57BL/6-muizen die genetisch gemodificeerd waren om een ​​verbeterd groen fluorescerend eiwit (GFP) tot expressie te brengen. De expressie van GFP-eiwit in de gmRPC's was van belang omdat het visualisatie van transplantaten na injectie mogelijk maakt zonder de noodzaak van aanvullende labeling. Voor het huidige onderzoek werden gmRPC's gekweekt in Advanced DMEM/F12 aangevuld met N-2 Supplement (1:100, Life Technology, Carlsbad, CA, VS), Glutamax-1 (1:100, Life Technology , Carlsbad, CA, VS) en EGF (20 ng / ml, recombinant, Human, Life Technologies, Carlsbad, CA, VS) en geïncubeerd bij 37 ◦C en 5% CO2. De cellen werden in gemengde suspensie/losjes gehechte kolonies in onbeklede weefselkweekflessen gehouden. De cellen werden via trypsinisatie met TrypLE Select CTS (Life Technologies, Carlsbad, CA, VS) gedurende één minuut 1:5 verdund in PBS en geneutraliseerd met 10 keer het toegevoegde volume trypsine. Het cel-trypsinemengsel werd 2 minuten bij kamertemperatuur bij 140 g gecentrifugeerd, het supernatant werd verwijderd en de celpellet werd opnieuw in vers medium gesuspendeerd voordat het in de gewenste concentratie in weefselkweekflessen werd geplaatst. Celconcentratie en levensvatbaarheid werden bepaald via trypaanblauwkleuring; tellingen werden uitgevoerd door Countess (Life Technologies, Carlsbad, CA, VS) en hemocytometer.

Voor intravitreale injecties werd de celpellet geresuspendeerd bij 50K cellen/μl in BSS PLUS®. Celconcentratie en levensvatbaarheid werden vóór en na injecties geëvalueerd. De geïnjecteerde dosis was 50,000 cellen per oog per injectie. De dosis en het vehikel werden geselecteerd op basis van onze eerdere onderzoeken.

4.2. Experimentele dieren

Het doel van de huidige studie was om de potentiële allogene immuunreacties te onderzoeken die worden geïnduceerd via herhaalde intravitreale injectie van allogene RPC's. De ontvangende dieren waren BALB/c-muizen, die genetisch verschillen van de C57BL/6-muizen waaruit de gmRPC's werden geïsoleerd. Het gebruik van ten minste drie dieren per behandelde experimentele groep voor elk tijdstip werd nodig geacht om de evaluatie van de statistische significantie tussen groepen mogelijk te maken met betrekking tot uitkomstvariabelen en potentiële verliezen van dieren tijdens de experimentele periode. Bovendien werden, gezien de vele aanvullende factoren die mogelijk van invloed zijn op de experimentele uitkomst, zoals een mislukte celinjectieprocedure of mogelijke uitputting als gevolg van dierengevechten, injectieprocedures uitgevoerd op vijf dieren per groep om er verder voor te zorgen dat aan de minimumaantallen werd voldaan die vereist zijn voor statistische analyse.

cistanche tubulosa-verbetering van het immuunsysteem

Tabel 1 toont de vier groepen dieren die zijn voorbereid voor elk van de vier tijdstippen (4, 7, 14 en 28 dagen) waarop evaluaties van histopathologie, inclusief immunofluorescentie, zouden worden uitgevoerd. Twee extra groepen dieren die intraperitoneaal waren geïnjecteerd met 10ˆ6 gmRPC's werden voorbereid als positieve controles voor elk van de twee ELISPOT-evaluatietijdstippen (14 en 28 dagen). Tabel 2 vat de geplande evaluaties voor elke groep samen.

Tabel 1. Experimentele groepen.

Tabel 2. Evaluatiemomenten.

4.3. Intravitreale injectie

De gmRPC's werden toegediend via intravitreale injectie. Eenmaal verdoofd werden Mydriacyl (1% Tropicamide oftalmische oplossing) en Phenylephrine (2,5% oftalmische oplossing) aangebracht op beide ogen van het te injecteren dier. Wanneer adequate mydriasis was bereikt, werd het dier met de hand vastgehouden en werd de kop van het dier gedraaid om de oculaire as van het te injecteren oog uit te lijnen met de optica van de chirurgische microscoop om zo het achterste oculaire segment (dat wil zeggen glasvocht en netvlies) zichtbaar te maken. . Het oog werd voorzichtig handmatig voorgesteld via druk op de oogleden en een 31G-naald op een insulinespuit werd gebruikt om voorzichtig de sclera grenzend aan de limbus in het onderste neuskwadrant te doorboren. Een micropipetpunt van gepolijst glas met daarin donorcellen (of vehikelcontrole) werd onder directe visualisatie door de incisie in de glasachtige holte gebracht. Er werd voor gezorgd dat de integriteit van de lens of de structuren van het achterste segment niet werd verstoord. De cellen of vehikels alleen werden geïnjecteerd in een volume van 1 microliter. Na enkele momenten van pauze om evenwicht van de intraoculaire druk mogelijk te maken, werd de pipetpunt geleidelijk uit het oog verwijderd, alles onder directe visualisatie. Elke intraoculaire bloeding werd genoteerd, samen met de locatie. Na de injectie werd het dier in een schone kooi geplaatst, bekleed met een vers wegwerpkussentje, met de absorberende kant naar boven/plastic naar beneden gericht, om te herstellen. Het herstel werd vergemakkelijkt met behulp van een verwarmingskussen en werd geverifieerd door het vermogen van het dier om te lopen. Na het ontwaken werd het dier overgebracht naar de postoperatieve kooi met ad libitum toegang tot water. Dieren werden postoperatief dagelijks visueel gevolgd. Er werden minimale of geen tekenen waargenomen die verband hielden met intraoculaire injectie.

Na de procedure werden de dieren geobserveerd op wrijven over het geopereerde oog, verstoorde vacht of aanhoudende lethargie, allemaal redenen voor onmiddellijke euthanasie. Er werden twee dieren gedood als gevolg van verwondingen opgelopen tijdens gevechten. Alle andere dieren werden op de geplande eindpunten beëindigd. Euthanasie vond plaats via CO2-inhalatie.

4.4. Oftalmisch onderzoek

A Leica Ultimate Red Reflex Surgical Microscope was used for ophthalmic examination and photography of experimental mice. Sedation was performed with a Ketamine Hydrochloride/Xylazine Hydrochloride mixture (50–100 mg/mL Ketamine, 5–10 mg/mL Xylazine) administered by intraperitoneal injection. After sedation, topical mydriatics (Tropicamide, Phenylephrine) were applied to the eye(s) to be imaged in 5 min intervals until adequate mydriasis was achieved, as determined via pupil diameter (>2,5 mm) en reactie op lichtstimulatie. Ter compensatie voor het verlies van het knipperen werd indien nodig topisch een oplossing van hypromellose (Gonak) op beide ogen aangebracht om uitdroging van het hoornvlies te voorkomen. Voor de beeldvormingsprocedure werden verdoofde dieren op een verwarmingskussen geplaatst en in sternumligging geplaatst. Aan het einde van de procedure werd een gedeeltelijke opheffing van de anesthesie bereikt door toediening van Atipamezol (0,1–1 mg/kg) via intraperitoneale injectie.

4.5. Histopathologie

De immuunresponsen bij dieren die twee opeenvolgende transplantaten ontvingen (één in elk oog) werden geëvalueerd via histopathologie van beide ogen op dag 4, dag 7, dag 14 en dag 28 ± 1 na injectie van het tweede oog. De muizen die werden behandeld volgens Tabel 1 werden gedood op basis van het aangegeven schema in Tabel 2. Dieren werden geëuthanaseerd met behulp van kooldioxide-inhalatie. Bij de proefdieren werden hartperfusies uitgevoerd met 2% paraformaldehyde (PFA) in fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS). Vervolgens werden alle oogbollen verzameld en 48 uur bij 4 °C in 2% PFA/PBS geweekt. De gefixeerde oogbollen werden verwerkt via een sucrosegradiënt (10% sucrose in PBS gedurende 1 uur bij kamertemperatuur, 20% sucrose in PBS gedurende 1 uur bij kamertemperatuur en 30% sucrose in PBS bij 4 °C gedurende de nacht) voordat ze werden ingebed in OCT-media voor cryosectie. Cryosecties (10 µm) van de ogen werden gekleurd met Harrison-hematoxyline en eosine (H&E) om de microanatomie van het netvlies zichtbaar te maken en de geïnjecteerde donorcellen te lokaliseren.

Voor de met gmRPC behandelde groepen werden cryosecties geëvalueerd met behulp van immunofluorescentie voor GFP+ (donor)cellen. Identificatie van de specifieke immuunceltypen die in de ogen aanwezig zijn, werd uitgevoerd door middel van labeling met specifieke primaire antilichamen voor het volgende: CD3 (T-lymfocytmarker) [35], CD45R (B-lymfocytmarker) [36], Iba-1 (geactiveerde macrofaag- en microglia-marker) [37], Ly-6G (neutrofielen-marker) [38] en CD49b (natural killer-celmarker) [39]. Cryocoupes werden driemaal bij kamertemperatuur gewassen in PBS en geblokkeerd met 0.03% Triton X-100 en 10% normaal geitenserum in PBS (NGS; Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA, VS) voor 1 uur bij kamertemperatuur. Ratten-anti-muis CD3 (1:100 verdunning, BD Biosciences, San Jose, CA, VS), ratten-anti-muis CD45R (1:100, BD Biosciences, San Jose, CA, VS), konijnen-anti-muis Iba{{ 26}} (verdunning 1:400, Wako Chemicals, Richmond, VA, VS), anti-muis Ly-6G van rat (verdunning 1:100, BD Biosciences, San Jose, CA, VS) en anti-rat -muis CD49b (verdunning 1:100, BD Biosciences, San Jose, CA, VS) werd op monsters aangebracht en overnacht bij 4 graden geïncubeerd. Monsters werden opnieuw driemaal bij kamertemperatuur gewassen in PBS. Alexa-Fluor-geconjugeerde secundaire antilichamen (geit anti-rat Alexa-Flour-568 en geit anti-konijn Alexa-Flour-568, Life Technologies, Carlsbad, CA, VS) werden gedurende 1 uur op monsters aangebracht. op kamertemperatuur. Alle monsters werden vervolgens nog driemaal bij kamertemperatuur in PBS gewassen. Dekglaasjes werden gemonteerd met behulp van DAPI Fluoromount-G (Southern Biotech, Birmingham, AL, VS) en de objectglaasjes lieten ze een nacht bij kamertemperatuur drogen.

4.6. ELISPOT- en MLR-tests

RPC-specifieke geheugen-T-cellen werden 2 en 4 weken na de eerste transplantaatplaatsing gevolgd via een enzymgekoppelde immunosorbentspot (ELISPOT) -test. De experimentele groepen werden voor elk tijdstip opgezet zoals weergegeven in Tabellen 1 en 2. De ELISPOT-test vangt uitgescheiden eiwitten op een specifieke met antilichamen gecoate microplaat op en kan worden gebruikt om de activatie van geheugen-T-cellen te bepalen door de IFN-secretie van T-cellen te detecteren. De experimentele uitlezing is het aantal IFN-vlekken op de microplaat. Het aantal aanwezige IFN-vlekken is indicatief voor het aantal T-cellen dat wordt geactiveerd. De frequentie van alloreactieve T-cellen werd beoordeeld door een gemengde leukocytenreactie (MLR) van 48 uur uit te voeren op 96-well Multiscreen-IP-platen (Millipore, Burlington, MA, VS). Respondercellen waren lymfocyten/splenocyten die T-cellen bevatten die waren gezuiverd uit cervicale lymfeknopen (CLN's) en milten van de proefdieren, en stimulatorcellen waren de gmRPC's die oorspronkelijk waren afgeleid van C57BL/6-muizen. De ELISPOT-testen werden uitgevoerd op basis van een standaardprotocol. 96-well Multiscreen-IP-platen werden onder steriele omstandigheden vooraf bevochtigd met 15 µl 35% ethanol per well. De platen werden driemaal gewassen met steriele PBS voordat 100 µl van het IFN-vangantilichaam (kloon AN-18, eBioscience, San Diego, CA, VS) verdund in PBS (2 µg/ml) op de platen werd aangebracht. De platen werden overnacht bij 4 graden geïncubeerd voordat de MLR-testen op de platen werden uitgevoerd. De met vangantilichaam gecoate platen werden driemaal gewassen met PBS en vervolgens gedurende 2 uur bij 37 °C geblokkeerd met RPMI1640.

Elk van de testplaten bevatte de volgende controles: putjes die geen cellen bevatten, putjes die de cellen bevatten zonder stimulatie, en putjes die de cellen bevatten met behandelingen met forbol {{0}} myristaat 13-acetaat (PMA) en Ca-ionofoor als positieve controles. PMA-behandeling dient als een positieve controle door de tweede boodschapper, DAG, na te bootsen om de T-celreceptorroute te activeren en op zijn beurt T-celactivering te veroorzaken, waarbij Ca-ionofoor het binnendringen van calciumionen in cellen vergemakkelijkt. De platen werden vóór de kleurreactie 36 uur bij 37 °C geïncubeerd. De platen werden zes keer gewassen met PBS met {{10}}.01% Tween 20 en vervolgens 100 µl detectie-antilichaam (kloon R64A2, eBioscience, San Diego, CA, VS), verdund in PBS (0,5 µg/ml) werd op elk putje aangebracht. De platen werden nog eens 2 uur bij 37 °C geïncubeerd. De platen werden opnieuw gewassen met 0,01% Tween 20 in PBS. Er werd 100 µl Streptavidine-AP (verdunning 1:1000, Invitrogen) per putje aangebracht en de platen werden 45 minuten bij kamertemperatuur geïncubeerd. Alle platen werden opnieuw drie keer gewassen met 0,01% Tween 20 in PBS en nog eens drie keer alleen met PBS. Tenslotte werd 100 µl BCIP/NBT (Sigma Aldrich, München, Duitsland) aan elk putje toegevoegd voor kleuring. Alle platen werden uitgebreid gewassen met kraanwater en gedroogd vóór gegevensanalyse.

cistanche tubulosa-verbetering van het immuunsysteem

5. Conclusies

Deze studie toont aan dat opeenvolgende binoculaire transplantaten van allogene RPC's in de glasachtige holte geen klassieke immuunafstoting veroorzaken bij de muis. Hoewel erkend wordt dat deze allogene histologische onderzoeken niet konden worden uitgevoerd met een klinisch product van menselijk RPC, lijken de gegevens consistent met de resultaten van een klinisch veiligheidsonderzoek (jCyte, JC-01E, niet-gepubliceerde gegevens) waarin patiënten met retinitis pigmentosa ontving niet-gelijktijdige bilaterale injecties zonder immunosuppressieve behandelingen. Hoewel het moeilijk is om de twee onderzoeken rechtstreeks te vergelijken, is het opmerkelijk dat de algehele uitkomsten van beide overeenkomsten vertoonden in termen van allograft-overleving.

Referenties

1. Hori, J.; Ng, TF; Shatos, M.; Klassen, H.; Streilein, JW; Jonge, MJ Neurale voorlopercellen missen immunogeniciteit en zijn bestand tegen vernietiging als allotransplantaten. Stamcellen 2003, 21, 405–416. [Kruisref] [PubMed]

2. Klassen, H.; Schwartz, PH; Ziaeian, B.; Nethercott, H.; Jong, MJ; Bragadottir, R.; Tullis, GE; Warfvinge, K.; Narfstrom, K. Neurale voorlopers geïsoleerd uit de zich ontwikkelende kattenhersenen vertonen retinale integratie na transplantatie naar het netvlies van de dystrofische kat. Dierenarts. Oftalmol. 2007, 10, 245–253. [Kruisref] [PubMed]

3. Salado-Manzano, C.; Perpina, U.; Straccia, M.; Molina-Ruiz, FJ; Cozzi, E.; Rosser, AE; Canals, JM Is de immunologische respons een knelpunt voor celtherapie bij neurodegeneratieve ziekten? Voorkant. Cel Neurosci. 14, 2020, 250. [Kruisref]

4. Petrus-Reurer, S.; Romano, M.; Howlett, S.; Jones, JL; Lombardi, G.; Saeb-Parsy, K. Immunologische overwegingen en uitdagingen voor regeneratieve cellulaire therapieën. Gemeenschappelijk. Biol. 4, 798 2021. [Kruisref]

5. Bucher, K.; Rodriguez-Bocanegra, E.; Dauletbekov, D.; Fischer, MD Immuunreacties op retinale gentherapie waarbij geen geassocieerde virale vectoren worden gebruikt - implicaties voor het succes en de veiligheid van de behandeling. Prog. Retin. Oogonderzoek. 2021, 83, 100915. [Kruisref]

6. Singh, lidstaten; Park, SS; Albini, TA; Canto-Soler, MV; Klassen, H.; MacLaren, RE; Takahashi, M.; Nagiel, A.; Schwartz, SD; Bharti, K. Retinale stamceltransplantatie: evenwicht tussen veiligheid en potentieel. Prog. Retin. Oogonderzoek. 2020, 75, 100779. [Kruisref]

7. Kamao, H.; Mandai, M.; Okamoto, S.; Sakai, N.; Suga, A.; Sugita, S.; Kiryu, J.; Takahashi, M. Karakterisering van door de mens geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide retinale pigmentepitheelcelbladen gericht op klinische toepassing. Stamcelvertegenwoordiger. 2014, 2, 205–218. [Kruisref]

8. Sugita, S.; Kamao, H.; Iwasaki, Y.; Okamoto, S.; Hashiguchi, T.; Iseki, K.; Hayashi, N.; Mandai, M.; Takahashi, M. Remming van T-celactivatie door retinale pigmentepitheelcellen afgeleid van geïnduceerde pluripotente stamcellen. Onderzoek. Oftalmol. Vis. Wetenschap 2015, 56, 1051–1062. [Kruisref]

9. McGill, TJ; Stoddard, J.; Renner, LM; Messaoudi, ik; Bharti, K.; Mitalipov, S.; Lauer, A.; Wilson, DJ; Neuringer, M. Allogene iPSC-afgeleide RPE-celtransplantaatfalen na transplantatie in de subretinale ruimte bij niet-menselijke primaten. Onderzoek. Oftalmol. Vis. Wetenschap 2018, 59, 1374–1383. [Kruisref]

10. Sugita, S.; Mandai, M.; Kamao, H.; Takahashi, M. Immunologische aspecten van RPE-celtransplantatie. Prog. Retin. Oogonderzoek. 2021, 84, 100950. [Kruisref]

11. Nair, DSR; Thomas, BB Op stamcellen gebaseerde behandelstrategieën voor degeneratieve ziekten van het netvlies. Huidig Stamcelonderzoek. Daar. 2022, 17, 214–225. [Kruisref] [PubMed]

12. Martinez Velazquez, LA; Ballios, BG De volgende generatie moleculaire en cellulaire therapieën voor erfelijke netvliesaandoeningen. Int. J. Mol. Wetenschap 22, 2021, 11542. [Kruisref]

13. Liu, Y.; Chen, SJ; Li, SY; Qu, LH; Meng, XH; Wang, Y.; Xu, HW; Liang, ZQ; Yin, ZQ Langetermijnveiligheid van menselijke retinale voorloperceltransplantatie bij retinitis pigmentosa-patiënten. Stamcelonderzoek. Daar. 8, 2017, 209. [Kruisref] [PubMed]

14. Wang, Y.; Tang, Z.; Gu, P. Stam- / voorlopercelgebaseerde transplantatie voor retinale degeneratie: een overzicht van klinische onderzoeken. Celdood Dis. 11, 793 2020. [Kruisref] [PubMed]

15. Duits, OL; Vallese-Maurizi, H.; Soto, TB; Rotstein, NP; Politi, LE Retina-stamcellen, hoop en obstakels. Wereld J. Stamcellen 2021, 13, 1446–1479. [Kruisref]

16. Karamali, F.; Behtaj, S.; Babaei-Abraki, S.; Hadady, H.; Atefi, A.; Savoj, S.; Soroushzadeh, S.; Najafian, S.; Nasr Esfahani, MH; Klassen, H. Potentiële therapeutische strategieën voor degeneratie van fotoreceptoren: het pad om het gezichtsvermogen te herstellen. J. Vert. Med. 20, 20, 572 2022. [Kruisref]

17. Semo, M.; Haamedi, N.; Stevanato, L.; Carter, D.; Brooke, G.; Jong, M.; Coffey, P.; Sinden, J.; Patel, S.; Vugler, A. Werkzaamheid en veiligheid van menselijke retinale voorlopercellen. Vert. Vis. Wetenschap Technologie 2016, 5, 6. [Kruisref]

18. Mochizuki, M.; Sugita, S.; Kamoi, K. Immunologische homeostase van het oog. Prog. Retin. Oogonderzoek. 2013, 33, 10–27. [Kruisref]

19. Yamasaki, S.; Sugita, S.; Horiuchi, M.; Masuda, T.; Fujii, S.; Makabe, K.; Kawasaki, A.; Hayashi, T.; Kuwahara, A.; Kishino, A.; et al. Lage immunogeniciteit en immunosuppressieve eigenschappen van menselijke ESC- en iPSC-afgeleide netvliezen. Stamcelvertegenwoordiger 2021, 16, 851–867. [Kruisref]

20. Klassen, H.; Schwartz, heer; Bailey, AH; Young, MJ Oppervlaktemarkers die tot expressie worden gebracht door multipotente neurale voorlopercellen van mens en muis omvatten tetraspanines en niet-eiwitepitopen. Neurowetenschappen Let. 2001, 312, 180–182. [Kruisref]

21. Klassen, H.; Ziaeian, B.; Kirov, II; Jong, MJ; Schwartz, PH Isolatie van retinale voorlopercellen uit post-mortem menselijk weefsel en vergelijking met autologe hersenvoorlopercellen. J. Neurosci. Res. 2004, 77, 334-343. [Kruisref]

22. Ingulli, E. Mechanisme van cellulaire afstoting bij transplantatie. Kindergeneeskunde Nefrol. 2010, 25, 61–74. [Kruisref]

23. Issa, F.; Schiopu, A.; Wood, KJ Rol van T-cellen bij transplantaatafstoting en transplantatietolerantie. Deskundige ds. Clin. Immunol. 2010, 6, 155–169. [Kruisref] [PubMed]

24. Nasr, M.; Sigdel, T.; Sarwal, M. Vooruitgang in de diagnostiek voor transplantaatafstoting. Deskundige ds. Mol. Diagnose. 2016, 16, 1121–1132. [Kruisref] [PubMed]

25. Klassen, H.; Imfeld, KL; Ray, J.; Jong, MJ; Gage, FH; Berman, MA De immunologische eigenschappen van volwassen hippocampale voorlopercellen. Vis. Res. 2003, 43, 947-956. [Kruisref] [PubMed]

26. Weinger, JG; Weist, BM; Geplastificeerd, toilet; Klaus, SM; Walsh, CM; Lane, TE MHC-mismatch resulteert in afstoting van neurale voorlopercellen na ruggenmergtransplantatie in een model van door virussen geïnduceerde demyelinisatie. Stamcellen 2012, 30, 2584-2595. [Kruisref] [PubMed]

27. ReNeuron, L. First-in-Human fase I/IIa, open-label, prospectief onderzoek naar de veiligheid en verdraagbaarheid van subretinaal getransplanteerde menselijke retinale voorlopercellen (hRPC) bij patiënten met retinitis pigmentosa (RP). Klinische proef# NCT02464436. Online beschikbaar: https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT02464436 (geraadpleegd op 27 februari 2023).

28. Lu, B.; Lin, Y.; Tsai, Y.; Girman, S.; Adamus, G.; Jones, MK; Shelley, B.; Svendsen, CN; Wang, S. Een daaropvolgende transplantatie van menselijke neurale voorlopercellen in het gedegenereerde netvlies brengt de initiële overleving van het transplantaat of de therapeutische werkzaamheid niet in gevaar. Vert. Vis. Wetenschap Technologie 2015, 4, 7. [Kruisref] [PubMed]

29. Jones, MK; Lu, B.; Girman, S.; Wang, S. Op cellen gebaseerde therapeutische strategieën voor vervanging en behoud bij degeneratieve ziekten van het netvlies. Prog. Retin. Oogonderzoek. 2017, 58, 1–27. [Kruisref] [PubMed]

30. Bell, BA; Kaul, C.; Bonilha, VL; Rayborn, IK; Sadrach, K.; Hollyfield, JG De BALB/c-muis: effect van standaard vivariumverlichting op retinale pathologie tijdens veroudering. Uitv. Oogonderzoek. 2015, 135, 192–205. [Kruisref]

31. Klassen, HJ; Ng, TF; Kurimoto, Y.; Kirov, ik.; Shatos, M.; Coffey, P.; Young, MJ Multipotente retinale voorlopercellen brengen ontwikkelingsmarkers tot expressie, differentiëren in retinale neuronen en behouden lichtgemedieerd gedrag. Onderzoek. Oftalmol. Vis. Wetenschap 2004, 45, 4167-4173. [Kruisref]

32. jCyte, Inc. Veiligheid van een enkele, intravitreale injectie van menselijke retinale voorlopercellen (jCell) bij Retinitis Pigmentosa. Klinische proef# NCT02320812. Online beschikbaar: https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT02320812 (geraadpleegd op 24 februari 2023).

33. jCyte, Inc. Veiligheid en werkzaamheid van intravitreale injectie van menselijke retinale voorlopercellen bij volwassenen met retinitis pigmentosa. Klinische proef# NCT03073733. Online beschikbaar: https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT03073733 (geraadpleegd op 24 februari 2023).

34. jCyte, Inc. Veiligheid van herhaalde intravitreale injectie van menselijke retinale voorlopercellen (cel) bij volwassen proefpersonen met retinitis pigmentosa. Klinische proef# NCT04604899. Online beschikbaar: https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT04604899 (geraadpleegd op 24 februari 2023).

35. Oudejans, JJ; van der Valk, P. Immunohistochemische classificatie van T-cel- en NK-celneoplasmata. J. Clin. Pathol. 2002, 55, 892. [Kruisref] [PubMed]

36. Tostanoski, LH; Chiu, YC; Gammon, JM; Simon, T.; Andorko, JI; Bromberg, JS; Jewell, CM Het herprogrammeren van de micro-omgeving van de lokale lymfeklieren bevordert tolerantie die systemisch en antigeenspecifiek is. Celvertegenwoordiger 2016, 16, 2940–2952. [Kruisref] [PubMed]

37. Jurga, AM; Paleczna, M.; Kuter, KZ Overzicht van algemene en onderscheidende markers van differentiële Microglia-fenotypes. Voorkant. Cel Neurosci. 14, 2020, 198. [Kruisref] [PubMed]

38. Li, JC; Zou, XM; Yang, SF; Jin, JQ; Zhu, L.; Li, CJ; Yang, H.; Zhang, AG; Zhao, TQ; Chen, CY Extracellulaire vallen van neutrofielen nemen deel aan de ontwikkeling van kankergeassocieerde trombose bij patiënten met maagkanker. Wereld J. Gastro-enterol. 2022, 28, 3132–3149. [Kruisref]

39. Kee, BL Ontwikkeling van natuurlijke killercellen en ILC1. Encycl. Immunobiol. 2016, 1, 140–148.