Echografie-ondersteunde extractie van fenolzuren, flavonolen en flavanen-3-olen uit schillen en zaden van muskaatdruiven met behulp van natuurlijke diepe eutectische oplosmiddelen en voorspellende modellering door kunstmatige neurale netwerken

Neem contact oposcar.xiao@wecistanche.comvoor meer informatie

AbstractHet doel van deze studie was om de extractie-efficiëntie van 9 natuurlijke diepe eutectische oplosmiddelen (NDES) te onderzoeken met behulp van ultrageluid voorfenolzuren, flavonolen, en flavan-3-olen in schillen en zaden van muskaatdruiven (Carlos) in vergelijking met 75 procent ethanol. Kunstmatige neurale netwerken (ANN) werden toegepast om het NDES-watergehalte, de ultrasoonbehandelingstijd, de vaste stof-tot-oplosmiddelverhouding en de extractietemperatuur te optimaliseren om de hoogste extractieopbrengsten voor ellaginezuur, catechine en epicatechine te bereiken. Een nieuw geformuleerde NDES (#1) bestaat uit cholinechloride:levulinezuur: ethyleenglycol 1:1:2 en 20 procent water onttrokken met 22,1 mg/g de hoogste hoeveelheid ellaginezuur in de huid. Deze opbrengst was 1,73- maal die van 75 procent ethanol. Een gemodificeerde NDES (#3) bestaande uit cholinechloride: proline: appelzuur 1:1:1 en 30 procent water onttrokken de hoogste hoeveelheid catechine (0,61 mg/g) en epicatechine (0,89 mg/g) in de huid en respectievelijk 2,77 mg/g en 0,37 mg/g in het zaad. De optimale opbrengst aan ellaginezuur in de huid met NDES #1 was 25,3 mg/g (waargenomen) en 25,3 mg/g (voorspeld). De optimale opbrengst van (catechine plus epicatechine) in zaad met NDES #3 was 9,8 mg/g (waargenomen) en 9,6 mg/g (voorspeld). Deze studie toonde de hoge extractie-efficiëntie van geselecteerde NDES voor polyfenolen onder geoptimaliseerde omstandigheden.

Klik hier om meer te weten

Invoering

Natuurlijke diepe eutectische oplosmiddelen (NDES) worden bereid door waterstofbrugdonoren te mengen met waterstofbrugacceptoren in een geschikte molverhouding [1]. Het smeltpunt van de ene component moet lager zijn dan het smeltpunt van de andere [1]. Na verhitten en mengen wordt dit medium bij kamertemperatuur vloeibaar. Water wordt toegevoegd om het mengsel te stabiliseren en te polariseren. Onderzoek op het gebied van fytochemische extractie met behulp van NDES is uitgebreid vanwege hun effectieve extraheerbaarheid en oplosbaarheid. Desalniettemin spelen meerdere factoren een belangrijke rol bij het vergelijken van NDES met organische oplosmiddelen, waaronder opbrengst, kosten, terugwinning en toxiciteit. Eerder onderzoek onderzocht NDES op de extractie van verschillende polyfenolen uit verschillende voedselmatrices. Bijvoorbeeld Bubalo et al. (2016) vergeleken 5 NDES, water, 70 procent methanol (v/v) en aangezuurde 70 procent methanol (v/v) om anthocyanines, catechine en quercetine-3-O-glucoside uit rode druivenschillen te extraheren. Een NDES bestaande uit cholinechloride:oxaalzuur (1:1) met 25 procent water (v/v) bleek het meest efficiënte extractieoplosmiddel [2]. In een andere studie, Pani´c et al. (2019) testte 8 NDES en verzuurde 70 procent ethanol en observeerde cholinechloride: citroenzuur (2:1) met 30 procent water (v/v) als de beste NDES om anthocyanines uit druivenpulp te extraheren [3]. Muscadine-druiven (Vitis rotundifolia) zijn inheems in de zuidoostelijke staten en de eerste gecultiveerde wilde druif in de Verenigde Staten [4]. Muscadine-druiven worden geproduceerd in 12 staten en in totaal ongeveer 5000 acres [5]. Er zijn 100 variëteiten van muscadine-druiven en elk varieert in fysieke, sensorische of chemische kenmerken [4]. Onder hen is Carlos een veel aangeplante muscadinedruif vanwege de hoge oogstopbrengsten en de consistentie van de groei [4]. Carlos muscadine druif is middelgroot, brons van kleur, dikker in de schil en bevat gemiddeld vier zaden [6]. Muscadine-druiven bevatten aanzienlijke hoeveelhedenpolyfenolenwaarvan bekend is dat ze ontstekingen verminderen [7], de groei van prostaattumoren remmen [8] en de metabole reacties van diabetici verbeteren [9]. Muscadine-druivenpulp, een bijproduct van muscadine-druivensap of wijnbereiding, bestaat uit schillen en zaden. Een eerdere onderzoeksstudie gebruikte een mengsel van aceton: water: azijnzuur (70:29.7:0.3, v/v) om fenolverbindingen te extraheren uit de zaden, schil en pulp van acht cultivars van in Florida gekweekte muscadinedruif, waaronder Carlos [10]. Het gebruik van ontvlambare organische oplosmiddelen en hun lage extractie-efficiëntie belemmerden echter praktische toepassingen. Het grootste deel van het muscadine-druivenpulp wordt nog steeds als afval weggegooid. Kunstmatige neurale netwerken (ANN) is een niet-lineair kaartsysteem dat bestaat uit verschillende basisverwerkingseenheden die zijn verbonden door gewogen associaties. Deze verwerkingseenheden worden "neuronen" genoemd [11]. Kunstmatige neurale netwerken zijn een machine learning-benadering om een ​​reactie te voorspellen of te voorspellen op basis van meerdere inputs [11]. Voorafgaand onderzoek heeft responsoppervlakmethoden (RSM) toegepast voor extractie-optimalisatie en -voorspelling. Er zijn echter maar weinig onderzoeken die ANN voor hetzelfde doel hebben gebruikt. Bijvoorbeeld Sinha et al. (2013) suggereerde dat ANN betere voorspellingsprestaties heeft dan RSM bij de extractie van natuurlijke kleurstof uit zaden van Bixa Orellana (Annatto) [12]. In een soortgelijk onderzoek hebben Ciric et al. (2020) meldden dat het ANN-model beter was dan RSM voor het voorspellen van extracties van fenolverbindingen uit knoflook [13]. Het doel van dit onderzoek was om de extractie-efficiëntie van 9 NDES voor fenolzuren, flavonolen en flavan-3-olen te onderzoeken in vergelijking met 75 procent ethanol met behulp van ultrageluid. ANN werd toegepast om de extractieomstandigheden op fenolische opbrengst te voorspellen en te optimaliseren. De hypothese was dat NDES met specifieke samenstellingen grotere hoeveelheden fenolzuren, flavonolen en flavan-3-olen extraheren dan 75 procent ethanol, en de hoogste extractie-efficiëntie kan worden bereikt door voorspellende modellering op basis van ANN.

2. Materialen en methoden 2.1. Chemicaliën en reagentia Cholinechloride, levulinezuur, 1,2-propaandiol, DL-appelzuur, oxaalzuur, zoutzuur en mierenzuur werden verkregen van Acros Organics (Morris Plains, NJ, VS). Melkzuur, ethyleenglycol, glycine, HPLC-kwaliteit acetonitril, methanol en ethanol werden gekocht bij Fishers Scientific (Waltham, Massachusetts, VS). L-proline en betaïnehydrochloride werden gekocht bij Alfa Aesar (Ward Hill, MA, VS). HPLC-kwaliteitsstandaarden van ellaginezuur, galluszuur, ferulazuur, (plus) -catechine, (−) -epicatechine, myricetine, quercetine en kaempferol werden verkregen van Sigma Aldrich (St. Louis, MO, VS).

2.2. Ontwerp van NDESNDES #1–2 in Tabel 1 zijn ontworpen in onze vorige studie [14]. Cholinechloride in NDES #1–2 werd geselecteerd als waterstofacceptor, terwijl voor elke nieuwe NDES twee verschillende waterstofdonoren werden geselecteerd. Molaire verhoudingen tussen waterstofdonoren en acceptor en watergehalte werden bepaald in voorlopige experimenten. NDES #3-9 in Tabel 1 werden geselecteerd uit de literatuur omdat eerdere studies ze hebben aangewezen als effectieve NDES bij het extraheren van polyfenolen. Het watergehalte in NDES #3 is gewijzigd ten opzichte van de geciteerde literatuur. Er werd een verwarmingsmethode toegepast om de NDES te bereiden [15]. In het kort werd de waterstofbrugacceptor gemengd met elk van de waterstofbrugdonorcomponenten in Erlenmeyerkolven met een roerstaaf. Het mengsel in de kolf werd gesloten en ongeveer 30 min op 50 ◦C verwarmd of totdat zich een heldere vloeistof vormde en stabiel bleef bij kamertemperatuur. Het watergehalte in Tabel 1 werd berekend op basis van het uiteindelijke volume van NDES-mengsels. De pH van NDES vermeld in tabel 1 werd gemeten met behulp van een pH-meter (AB15, Accumet, Fisher Scientific, Waltham, MA, VS). 2.3. Monstervoorbereiding / extractie met echografie Bevroren schillen en zaden van muscadinedruiven (Vitis rotundifolia) (cultivar: Carlos) werden geleverd door Paulk Vineyards (Wray, Georgia, VS). Na het verwijderen van schillen, bladeren of bladstelen, werd het afvallen gescheiden in zaden en schil. De monsters werden vervolgens gedroogd met behulp van een vacuümoven (Isotemp, Model 285A, Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts, VS) bij 60 ◦C en een vacuümdruk lager dan -30 in.Hg. Vervolgens werden de monsters gehomogeniseerd tot een fijn poeder met behulp van een chimerische molen (A1{{105}}00, RRH Inc., 2800 W, Zhejiang, China). Met behulp van een aanvankelijke verhouding vaste stof tot oplosmiddel van 1:20 (g: ml), werd 0,50 g van ofwel muscadine-druivenschil of -zaad gemengd in 10 ml NDES of 75 procent ethanol in drievoud. De monsters werden vervolgens in een waterbad (60 C) geplaatst en gesoniceerd (VCX 1500, Sonics & Materials Inc., 1500- Watt, 50/60 Hz, Newtown, CT, VS) gedurende 30 minuten bij 100 procent amplitude voor twee ronden (15 min/ronde). Vervolgens werden de monsters onmiddellijk gecentrifugeerd (Sorvall ST 8, Fisher Scientific, Suzhou, China) bij 3.260 g totdat een helder supernatant werd verkregen. Ten slotte werden de supernatanten verzameld en bewaard in een vriezer bij -20 ◦C voor HPLC-analyse van fenolzuren (ellaginezuur, galluszuur, ferulazuur), flavonolen (myricetine, quercetine en kaempferol) en flavan-3-olen (catechine en epicatechine). 2.4. HPLC-analyses van fenolzuren, flavonolen en flavan-3-olen Fenolzuren, flavonolen en flavan-3-olen werden geanalyseerd op een HPLC-systeem (Agilent Technologies 1200, Waldbronn, Duitsland) volgens de methode beschreven in Sandhu en Gu (2013) [16]. Het HPLC-systeem bestaat uit een binaire pomp, een autosampler, een gethermostateerd kolomcompartiment, een diode-arraydetector en een fluorescentiedetector. Druivenschil of zaadextracten werden gehydrolyseerd vóór de analyses van fenolzuren en flavonolen. De hydrolyse werd uitgevoerd door 1 ml van het extract te mengen met 4 ml hydrolyse-oplossing (1,2 M HCl met 50 procent methanol) en in een waterbad te plaatsen (Precision, Model 2837, 400 W, 50/60 Hz, Thermo Scientific, Marietta , OH, VS) bij 90 ◦C gedurende 80 minuten. Vervolgens werden de monsters afgekoeld tot 25 ◦C gevolgd door sonicatie gedurende 5 minuten. De hydrolyse van het extract was niet nodig voor de analyse van catechine en epicatechine. De gehydrolyseerde en niet-gehydrolyseerde extracten werden vóór HPLC-analyses door een 0,45 m polytetrafluorethyleen (PTFE) membraan gefiltreerd. Voor het analyseren van ellaginezuur, galluszuur, ferulazuur, myricetine, quercetine, kaempferol, catechine en epicatechine werd 10 µL geïnjecteerd in een SB-C18-kolom (4,6 × 250 mm, 5 µm, Zorbax, Agilent, Santa Clara, CA, VERENIGDE STATEN VAN AMERIKA). De mobiele fasen waren (A) 0,5 procent mierenzuur en (B) 100 procent acetonitril. De stroomsnelheid was 1 ml / min met een gemodificeerde gradiënt van 25 minuten als volgt: 0-5 min, 10-30 procent B; 5-10 min, 30-40 procent B; 10–20 min, 40–50 procent B; 20-25 min, 50-10 procent B; gevolgd door 5 min equilibratie. De temperatuur van de kolom werd ingesteld op 30 °C. De detectiegolflengte was 260 nm voor ellaginezuur, galluszuur en ferulazuur en 360 nm voor myricetine, quercetine en kaempferol op een fotodiodearraydetector. De excitatie en emissie voor catechine en epicatechine waren respectievelijk 230 nm, 321 nm, met behulp van een fluorescentiedetector. Polyfenolverbindingen werden gekwantificeerd met behulp van standaardcurven van ellaginezuur, galluszuur, ferulazuur, myricetine, quercetine, kaempferol, catechine en epicatechine. Alle standaardcurven hadden 7 punten en R2 > 0,99. 2.5. Aangepast ontwerp voor kunstmatige neurale netwerken Vier onafhankelijke extractievariabelen met vier niveaus: watergehalte (15-60 procent), ultrasone trillingen tijd (5-35 min), vaste stof-oplosmiddelverhouding (1:5–1:20) en extractie temperatuur (30-60 ◦C) (Tabel S1) werden toegepast om de extractieopbrengst van fenolzuren, flavonolen en flavan-3-olen te optimaliseren. In tegenstelling tot de klassieke ontwerpen, zoals het ontwerp van het responsoppervlak, vereist ANN-gebaseerd ontwerp geen herhaalde runs en geeft het de voorkeur aan een andere datastructuur. In onze vorige studie [14] was ANN een betrouwbaardere methode voor het voorspellen van extractieopbrengst dan RSM. Daarom werd ANN in deze studie geselecteerd om de extractieopbrengst van ellaginezuur, catechine en epicatechine te voorspellen. Een aangepast ontwerp met 40 runs (tabel S2) is gegenereerd op JMP Pro (versie 14.2, SAS Institute Inc., Cary, NC, VS) om gegevens te leveren die specifiek zijn voor ANN-voorspellingsmodellering. Randomisatie van de 40 runs werd toegepast om elke bias te elimineren. De hoofdvergelijking van ANN wordt als volgt weergegeven: de=∑jj=1 wh jpg plus bhk, k=1toK (1) waarbij h het aantal neuronen in de verborgen laag is, j en k zijn respectievelijk het aantal invoervariabelen en verborgen neuronen, p is de invoervariabele, bh is de bias van de verborgen laag en wh is het gewicht in de verborgen laag. Extractieopbrengsten van ellaginezuur, catechine en epicatechine in relatie tot de vier onafhankelijke variabelen werden geanalyseerd met behulp van ANN door eerst de gegevens te trainen en vervolgens het beste activeringstype en een aantal neuronen te kiezen dat resulteert in een adequate pasvorm van de gegevens. Om het succes van voorspellingsmodellen te evalueren, zijn drie waarden beoordeeld: R-kwadraat, de vierkantswortel van de gemiddelde kwadratische voorspellingsfout (RASE) (vergelijking (2)) en de gemiddelde absolute fout (AAE). RASE is RASE=̅̅̅̅̅̅̅̅̅̅̅̅̅ SSE/n √ (2) Waarbij SSE doneert voor het kwadraat en optellen van de voorspellingsfouten (verschillen tussen de werkelijke reacties en de voorspelde reacties) en n voor een aantal waarnemingen. R-kwadraat dicht bij 1 met RASE en AAE dicht bij nul betekent dat de gegevens beter in het model passen. 2.6. Statistieken Extractieopbrengsten van fenolzuren, flavonolen en flavan-3-olen werden vergeleken met one-way ANOVA gevolgd door Student's t-test bij p Minder dan of gelijk aan 0,05 met behulp van JMP Pro (versie 14.2, SAS Institute Inc., Cary, North Carolina, VS). Elke nde en 75 procent ethanol werden vergeleken met behulp van Dunnett's tests bij p Kleiner dan of gelijk aan 0,05. Principe-componentenanalyse (PCA) werd uitgevoerd op JMP Pro (versie 14.2, SAS Institute Inc., Cary, NC, VS) voor de fenolische verbindingen die zijn geëxtraheerd uit de schil en het zaad van muscadinedruiven. 3. Resultaten en discussie 3.1. Polyfenolen geëxtraheerd door NDES uit muscadine-druivenschillen Negen NDES en 75 procent ethanol werden gebruikt voor de extractie van polyfenolen uit de schillen van muscadine-druiven. Tabel 2 toont de extractieopbrengst van ellaginezuur, galluszuur, ferulazuur, myricetine, quercetine, kaempferol, catechine en epicatechine. Ellaginezuur was het meest voorkomende extraheerbare polyfenol in druivenhuid, gevolgd door respectievelijk galluszuur en ferulazuur. Deze bevinding was consistent met eerdere studies [17,18]. NDES #1, #8, #7, #3, #2 en #9 extraheerden significant hogere hoeveelheden ellaginezuur in de druivenschil dan 75 procent ethanol. De hoogste extractieopbrengst van ellaginezuur werd bereikt door NDES #1 gevolgd door NDES #8 bij respectievelijk 22,1 ± 2,2 mg/g en 21,3 ± 2,5 mg/g (tabel 2). Er was echter geen significant verschil tussen NDES #1 en NDES #8 volgens de Student's t-test. Interessant is dat NDES #1 de minst effectieve NDES bleek te zijn om anthocyanines uit te extraheren

cranberrypulp [14]. Dit suggereerde dat NDES #1 selectief ellaginezuur of ellagitannines kan extraheren uit voedselmatrix die ook anthocyanidinen bevatten. Een dergelijke selectiviteit kan worden toegeschreven aan verschillen in de moleculaire interacties tussen de NDES en specifieke fenolische klassen. Figuur S1 (paneel A) toont het HPLC-chromatogram van galluszuur, ellaginezuur en ferulazuur geëxtraheerd uit druivenhuid door NDES #1 en gedetecteerd bij 260 nm. De 75 procent ethanol geëxtraheerd 12,7 ± 1,2 mg ellaginezuur per gram druivenschil. De laagste extractieopbrengst van ellaginezuur werd waargenomen in NDES #4 bij 7,44 ± 0,6 mg/g. De extractieopbrengst van galluszuur door NDES #9, #8, #1, #4, #7 en #3 was vergelijkbaar en significant hoger dan 75 procent ethanol. De hoogste hoeveelheid galluszuur werd geëxtraheerd door NDES #9 op 10,4 ± 0,5 mg/g, terwijl de laagste hoeveelheid van 5,55 ± {{4{0}} 0,1 mg/g werd geëxtraheerd met NDES #5. De hoogste hoeveelheid ferulinezuur werd geëxtraheerd door NDES #1 bij 6,32 ± 0,7 mg/g en de laagste hoeveelheid werd geëxtraheerd door NDES #5 bij 3,11 ± 0.{{5{{52 }}}} mg/g. Verder was er geen significant verschil tussen NDES #1 en de 75 procent ethanol bij het extraheren van ferulinezuur (Tabel 2). De hoogste hoeveelheid catechine en epicatechine werd geëxtraheerd door NDES #3 bij 0,61 ± 0,1 mg/g en 0,89 ± 0,1 mg/ g, respectievelijk (Tabel 2). Ondertussen hebben NDES #3 en #6 significant grotere hoeveelheden epicatechine geëxtraheerd dan 75 procent ethanol. Figuur S2 (paneel A) toont het HPLC-chromatogram van catechine en epicatechine geëxtraheerd door NDES #3 uit de druivenschil. Catechine werd echter niet gedetecteerd in het 75 procent ethanolextract. De laagste hoeveelheden catechine (0.02 mg/g) en epicatechine ({{90}},14 mg/g) werden geëxtraheerd met NDES #2 en NDES # 5, respectievelijk. Myricetine was de meest voorkomende flavonol en kaempferol was de minste. Dunnett's test onthulde dat BDE's en 75 procent ethanol vergelijkbaar waren bij het extraheren van myricetine, quercetine en kaempferol (Tabel 2). De hoogste hoeveelheid myricetine werd geëxtraheerd met NDES #1 (1,84 mg/g), gevolgd door 75 procent ethanol (1,73 mg/g) en vervolgens NDES #8 (1,67 mg/g). De hoogste hoeveelheid quercetine werd geëxtraheerd met 75 procent ethanol (0,41 mg/g), NDES #1 (0,40 mg/g) en NDES #8 ({ {143}},38 mg/g). Daarentegen werden de laagste hoeveelheden myricetine en quercetine geëxtraheerd door NDES #5 bij respectievelijk 0,87 mg/g en 0,27 mg/g. Deze bevinding benadrukt verder een algeheel zwak vermogen van NDES #5 om polyfenolen uit de druivenschil te extraheren. De hoogste hoeveelheid kaempferol werd geëxtraheerd met 75 procent ethanol (0.05 mg/g), en de laagste werd geëxtraheerd met NDES #5 en NDES#6 (0,03 mg/g). Figuur S1 (paneel B) toont het HPLC-chromatogram van myricetine, quercetine en kaempferol geëxtraheerd uit druivenhuid door NDES #1 gedetecteerd bij 360 nm. De hoogste som van fenolzuren, flavonolen en flavan-3-olen was 40,7 mg/g geëxtraheerd met NDES #1 gevolgd door 39,8 mg/g geëxtraheerd met NDES #8, terwijl de laagste som 18,4 mg/g geëxtraheerd was door NDES #5 (Tabel 2). De pH van NDES varieerde tussen 0,3 en 3,3 (tabel 1). De Rsquared-correlatie tussen de pH van BDE's en fenolzuren, flavonolen en flavan-3-olen-opbrengsten is weergegeven in Tabel 2. Het gebrek aan correlatie tussen pH en extractieopbrengsten suggereerde dat de pH geen invloed had op de extractie-efficiëntie. 3.2. Door NDES geëxtraheerde polyfenolen uit muscadine-druivenpitten De totale extractieopbrengsten van fenolzuren, flavonolen en flavan- 3-olen uit druivenpitten waren beduidend lager dan die uit schillen (tabel 3). De meest voorkomende extraheerbare polyfenolen in de zaden waren catechine en epicatechine, terwijl kaempferol niet werd gedetecteerd. De complexe zaadmatrix die olie bevat (13 procent, w/w droge base) is een mogelijke verklaring voor de lage extraheerbaarheid van fenolische verbindingen uit de druivenpitten [19]. De hoogste hoeveelheid catechine werd geëxtraheerd door NDES #3 bij 2,77 mg/g (Tabel 3). Deze opbrengst was significant hoger dan alle andere NDES en 75 procent ethanol. Figuur S2 (paneel B) toont het HPLC-chromatogram van catechine en epicatechine geëxtraheerd door NDES #3 uit druivenpitten. De laagste hoeveelheid catechine werd geëxtraheerd door NDES #5 bij 0,30 mg/g. Alle NDES behalve NDES #1, #2 en #9 extraheerden significant grotere hoeveelheden epicatechine dan 75 procent ethanol (Tabel 3). De hoogste epicatechineconcentraties werden geëxtraheerd met NDES #4 (0,71 mg/g) en NDES #5 (0,68 mg/g), terwijl de laagste werd geëxtraheerd met 75 procent ethanol (0,11 mg/g). Galluszuur was het meest voorkomende extraheerbare fenolzuur in de druivenpitten, gevolgd door respectievelijk ferulazuur en ellaginezuur. De hoogste hoeveelheid galluszuur werd geëxtraheerd met NDES #4 bij 0,45 mg/g, gevolgd door NDES #9 en NDES #8. Deze BDE's extraheren aanzienlijk grotere hoeveelheden galluszuur dan 75 procent ethanol. De laagste hoeveelheid galluszuur (0,2 mg/g) werd geëxtraheerd met NDES #3. De hoogste extractie

opbrengst aan ellaginezuur werd verkregen door NDES #9 (0.26 mg/g) gevolgd door NDES #6 (0.17 mg/g), die significant hoger waren dan 75 procent ethanol. Evenzo extraheerden BDE's #3 de laagste hoeveelheid ellaginezuur bij 0.05 mg/g. Bovendien extraheerden NDES #6, #7 en #3 significant grotere hoeveelheden ferulinezuur dan 75 procent ethanol. De laagste extractieopbrengst van ferulinezuur was 0,5 mg/g volgens NDES #5. Bovendien werd ferulazuur niet gedetecteerd in NDES #9-extract. Dit was waarschijnlijk omdat de oplosbaarheid van ferulazuur lager was in NDES #9 dan in andere BDE's. Het hoogste myricetine-extract werd verkregen met 75 procent ethanol en NDES #7 bij 0,18 mg/g, die hoger waren dan alle BDE's. De hoogste opbrengst van quercetine-extractie was volgens NDES #6 (0,14 mg/g) en NDES #3 (0,13 mg/g) en beide NDES waren beter dan 75 procent ethanol. Evenzo had de pH van NDES geen invloed op de extractieopbrengst, zoals blijkt uit de lage correlatie (R-kwadraat) tussen de pH van BDE's en opbrengsten van fenolzuren, flavonolen en flavan-3-olen vermeld in tabel 3. 3.3 . Principale componentenanalyse (PCA) werd uitgevoerd om de extractieopbrengst van verschillende fenolische verbindingen in druivenschil en zaden te associëren met BDE's en 75 procent ethanol (Fig. 1). De PCA werd uitgevoerd op een correlatiematrix om een ​​mogelijke selectiviteit van sommige BDE's voor het extraheren van specifieke fenolische verbindingen of groepen te detecteren. Ongeveer 85 procent van de variantie van huidgegevens werd verklaard door hoofdcomponenten 1 en 2. De laadgrafiek (Fig. 1B) toont een hoge correlatie tussen fenolzuren (ellaginezuur, galluszuur, ferulazuur) en flavonolen (myricetine, quercetine, en kaempferol). Om deze groepen te extraheren, zijn de beste oplosmiddelen NDES #1, #8, #7 en 75 procent ethanol, zoals weergegeven in de scoregrafiek (Fig. 1A). Ondertussen leken catechine en epicatechine gescheiden van de rest van de fenolische groepen. Zoals getoond in Fig. 1A, was NDES #3 selectief om catechine en epicatechine uit druivenschillen te extraheren. Dit was een interessante observatie omdat NDES#3 een van de minst effectieve NDES was om proanthocyanidinen te extraheren, dit zijn oligomeren en polymeren van catechine en epicatechine [14]. Dit suggereerde dat NDES #3 selectief kan zijn voor proanthocyanidinen met kleinere molecuulgroottes. De clustering van fenolische verbindingen op de laadgrafiek van de huid (Fig. 1B) was anders dan het zaad (Fig. 1D), ongeacht de lage opbrengsten van deze verbindingen in de druivenpitten. De eerste en tweede hoofdcomponenten verklaarden ongeveer 73 procent van de variantie van seed-gegevens. Quercetine, myricetine en ferulazuur werden efficiënter geëxtraheerd met NDES #6, #7 en 75 procent ethanol, zoals weergegeven in de scoregrafiek (Fig. 1C). Ellaginezuur en galluszuur werden effectiever geëxtraheerd door NDES #9. Opnieuw werd catechine met de hoogste efficiëntie geëxtraheerd door NDES #3, wat vergelijkbaar was met wat werd waargenomen met druivenschillen. Epicatechine werd met hogere efficiëntie geëxtraheerd door NDES #5, #4 en NDES #8.

3.4. Optimalisatie van extractie van fenolzuren en flavonolen uit schillen van muscadinedruiven en ANN-voorspellingsmodellering Cholinechloride: levulinezuur: ethyleenglycol 1:1:2 (NDES #1) vertoonde de hoogste extractieopbrengst voor ellaginezuur en werd daarom gekozen voor verdere optimalisatie en voorspelling. De effecten van vier factoren, waaronder watergehalte, ultrasone trillingen, vaste-tot-oplosmiddelverhouding en extractietemperatuur werden beoordeeld voor de extractie van fenolzuren en flavonolen. Verder werden vier niveaus voor elke extractiefactor toegepast in in totaal 40 gerandomiseerde runs. De experimentele extractieopbrengst van ellaginezuur, galluszuur, ferulazuur, myricetine en quercetine, samen met de som van deze vijf, wordt weergegeven in Tabel 4. Over het algemeen was het verschil in extractieopbrengst tussen de laagste en de hoogste relatief groot voor fenolzuren. De laagste opbrengst voor ellaginezuur was bijvoorbeeld 9.03 mg/g (run #17) en de hoogste was 25,3 mg/g (run #15), wat resulteerde in een verschil van 16,2 mg/g (loop #17). Bovendien was de laagste opbrengstsom 20,7 mg/g en de hoogste 71,5 mg/g. Dit illustreert de significante effecten van de verschillende niveaus van elke extractiefactor op het extractierendement. Run #15 heeft de hoogste hoeveelheid ellaginezuur geëxtraheerd. De extractieconditie van run #15 was 45 ml /10{{130}} ml watergehalte, 25 min ultrasone trillingen, 1:10 (g: ml) vaste-tot-oplosmiddelverhouding en extractietemperatuur van 60 ◦C. Figuur S3 toont het HPLC-chromatogram van geoptimaliseerde fenolzuren geëxtraheerd uit druivenschil door NDES #1 (run #15 in Tabel 4). Het hoogste galluszuur (18,7 mg/g) werd bereikt onder gebruikmaking van de extractieomstandigheden in proef #24 en het laagste was 6,63 mg/g bij gebruik van proef #40. Voor ferulinezuur geëxtraheerd run #22 de hoogste hoeveelheid bij 19,2 mg/g, terwijl er geen ferulinezuur werd gedetecteerd in runs #14, #17, #29 en #34. Run #22 werd geëxtraheerd met 60 ml/100 ml watergehalte, 5 min ultrasone trillingen, 1:5 voor vaste stof tot oplosmiddelverhouding en extractietemperatuur van 60 C. Run #2 geëxtraheerd de hoogste myricetine (10,1 mg/g) en quercetine (1,87 mg/g). De extractieomstandigheden van run #2 waren 60 ml /100 ml watergehalte, 35 min ultrasone trillingen, 1:20 voor vaste stof tot oplosmiddelverhouding en extractietemperatuur van 60 C. De laagste mijn zekere opbrengst (3,79 mg/g) werd geëxtraheerd door run#40. De contourgrafieken in Fig. 2 tonen het effect van extractieparameters (X1, X2, X3 en X4) op de voorspelde opbrengst van ellaginezuur geëxtraheerd door NDES #1 uit de druivenschil. De voorspelde opbrengsten van ellaginezuur in Tabel 4 werden gebruikt om deze telgrafieken te construeren. Elk paneel illustreert de impact van 2 extractieparameters. De contourlijnen zijn gelabeld met de opbrengst aan ellaginezuur (mg/g). Het optimale voorspelde watergehalte was ongeveer 35-45 ml/100 ml NDES, zoals weergegeven in Fig. 2B en 2C. Langere ultrasone trillingen tijd verhoogde de opbrengst van ellaginezuur (Fig. 2D en 2E), wat wijst op een cruciale rol van ultrasoonapparaat in NDES-extractie. Tijdens de extractie werden door het mengen van druivenschillen of zaden met NDES deeltjes en gas geïntroduceerd, waardoor akoestische cavitatieplaatsen voor ultrageluid werden toegevoegd om talloze kleine belletjes in de NDES te genereren. Het imploderen van deze bellen leidde tot extreme temperatuur, drukverschil, hoge afschuifkracht, macroturbulenties en micromenging, wat NDES effectief in beweging bracht om massadiffusie en -overdracht te versnellen. Wanneer cavitatiebellen implodeerden op het oppervlak van druivenpit- of huiddeeltjes, leidden de resulterende micro-jets en botsingen tussen deeltjes tot oppervlaktepeeling, erosie, deeltjesafbraak, sonoporatie en celverstoring [20]. Al deze mechanische effecten van door ultrageluid geïnduceerde cavitatie versterkten de penetratie van BDE's in het celinterieur, zodat intercellulaire fenolen uit de voedselmatrix werden overgebracht naar oplosmiddelen. De optimale verhouding vaste stof tot oplosmiddel was 1:10, zoals aangegeven door Fig. 2B, 2D en 2F. Ten slotte lijken hogere extractietemperaturen tot 60 ◦C een positief effect te hebben op de extraheerbaarheid van ellaginezuur, zoals weergegeven in Fig. 2C, 2E en 2F. Dit suggereert een direct verband tussen de extractietemperatuur en de opbrengst van ellaginezuur dat uit de druivenschil wordt geëxtraheerd. Opbrengsten van ellaginezuurextractie (tabel 4) werden geanalyseerd voor voorspellingsmodellering met behulp van kunstmatige neurale netwerken. De experimentele gegevens werden willekeurig opgesplitst in een trainingsset en een validatieset. De reden om een ​​door de statistische software ingestelde validatie op te nemen, is om overfitting te onderdrukken. Om de opbrengst van ellaginezuur (Y) te voorspellen, werden dezelfde vier onafhankelijke extractiefactoren (X1, X2, X3 en X4), 1-2 verborgen lagen met een ander aantal neuronen en drie activeringsfuncties beoordeeld. De toegepaste activeringsfuncties waren hyperbolische tangens, lineair en gaussiaans. Vervolgens werden de datasets getraind totdat een hoge R-kwadraatwaarde voor zowel training als validatie was bereikt. De voorspellingsgegevens en een model werden gegenereerd. De beste ANN-structuur werd gekozen door de vier ingangen (X1, X2, X3 en X4) te analyseren met één verborgen laag met behulp van de Gauss-functie met tien neuronen (Figuur S5). De R-kwadraat van trainings- en validatiesets was 0,99, terwijl de RASE en AAE van het model respectievelijk 0,062 en 0,044 waren. De R-kwadraat van de ANN-validatie van ellaginezuur in deze studie (0,99) was hoger dan de ANN-validatie van procyanidinen (0,95) en anthocyanines (0,91) in een eerdere studie [14]. Deze toename in R2 kan echter worden toegeschreven aan de beter gegenereerde modelfit van de gegevens in deze studie, wat te wijten zou kunnen zijn aan de kleinere experimentele fouten. De voorspellende ANN-modellen voor de extractie van ellaginezuur met behulp van NDES #1 werden weergegeven als vergelijking 3-13:

Cistanche voor het verbeteren van de immuniteit

Conclusie

De huidige bevindingen leverden verder bewijs op over de effectiviteit van NDES-capaciteiten om polyfenolen te extraheren uit bijproducten van de voedingsindustrie. De resultaten ondersteunden de hypothese van een superieure echografie-ondersteunde extractie van NDES meer dan 75 procent ethanol. NDES heeft effectief drie fenolzuren, twee flavonolen en drie flavan-3-olen geëxtraheerd uit druivenschillen en zaden. NDES #1 was de meest effectieve NDES om ellaginezuur te extraheren, terwijl NDES #3 opmerkelijk selectief was in het extraheren van catechine en epicatechine. Een merkbaar nadeel van NDES is hun hoge viscositeit, wat een uitdaging vormt tijdens hantering en terugwinning. In de huidige studie toonde kunstmatige neurale netwerken, ongeacht de uitkomstbeperkingen, een praktische benadering voor voorspellende modellering. BDE's zijn robuuste media om fytochemicaliën uit voedselsystemen terug te winnen. Sommige BDE's bevatten ook een minder giftig oplosmiddel om deze fytochemicaliën in levende cellen te bestuderen [21,22]. Eindelijk zijn natuurlijke diepe eutectische oplosmiddelen effectieve alternatieve extractiemedia voor organische oplosmiddelen.

Referenties

[1] W. Bi, M. Tian, ​​KH Row, Evaluatie van op alcohol gebaseerd diep eutectisch oplosmiddel bij extractie en bepaling vanflavonoïdenmet optimalisatie van responsoppervlaktemethodologie, J. Chromatogr. A 1285 (2013) 22-30, https://doi.org/10.1016/j. chroma.2013.02.041.
[2] M. Cvjetko Bubalo, N. ´ Curko, M. Tomaˇsevi´c, K. Kovaˇcevi´c Ghani's, I. Radojˇci´c Redovnikovi´c, Groene extractie van druivenhuidfenolen door gebruik te maken van diepe eutectische oplosmiddelen, Food Chem. 200 (2016) 159-166, https://doi.org/10.1016/j. foodchem.2016.01.040.
[3] M. Panic, V. Gunjevi´c, G. Cravotto, I. Radojˇci´c Redovnikovi´c, Mogelijke technologieën voor de extractie van anthocyanines uit druivenpulp met behulp van natuurlijke diepe eutectische oplosmiddelen in batches van maximaal een halve liter extractie van anthocyanines uit druivenpulp met behulp van NADES, Food Chem. 300 (2019) 125185, https://doi.org/10.1016/j.foodchem.2019.125185.
[4] M. Hoffmann, et al., Muscadine Grape Production Guide for the Southeast, North Carolina State University, NC State Extension Publications, 2020 https://content. ces.ncsu.edu/muscadine-druivenproductie-gids (geraadpleegd op 18 januari 2021). [5] Cline, B. en C. Fisk, Overzicht van muscadine-druivenareaal, cultivars en productiegebieden in het zuidoosten van de VS. Muscadine Grape Workshop voor coöperatieve voorlichters, in het kleine fruitconsortium in de zuidelijke regio. 2006: Consortium voor kleinfruit in de zuidelijke regio.
[6] PC Andersen A. Sarkhosh D. Huff J. Breman 2020 6 10.32473/edis-hs100-2020.
[7] P. Greenspan, et al., Ontstekingsremmende eigenschappen van de muscadine-druif (Vitis rotundifolia), J. Agric. Voedsel. Chem. 53 (22) (2005) 8481-8484, https://doi.org/10.1021/jf058015.
[8] DN Ignacio, KD Mason, EC Hackett-Morton, C. Albanese, L. Ringer, WD Wagner, PC Wang, MA Carducci, SK Kachhap, CJ Paller, J. Mendonca, L. Li Ying Chan, Bo Lin, DK Hartle, JE Green, CA Brown, TS Hudson, Muscadine-druivenschilextract remt prostaatkankercellen door celcyclusstilstand te induceren en migratie door hitteschokproteïne te verminderen 40, Heliyon 5 (1) (2019) e01128, https://doi .org/10.1016/j.heliyon.2019.e01128.