Inzicht in post-entry sortering van adenovirus-capsiden; Een kans om de eigenschappen van vaccinvectoren te wijzigen Deel 1

Abstract:

Genetische vaccins op basis van adenovirusvectoren zijn naar voren gekomen als een krachtige strategie tegen de gezondheidscrisis van SARS-CoV-2. Dit succes is niet onverwacht omdat adenovirussen vele wenselijke kenmerken van een genetisch vaccin combineren. Ze zijn zeer immunogeen en hebben een laag en goed gekarakteriseerd pathogeen profiel gecombineerd met technologische benaderbaarheid. Voortdurende inspanningen om adenovirus-vaccinvectoren te verbeteren omvatten het gebruik van zeldzame serotypen en niet-menselijke adenovirussen. In deze review concentreren we ons op de virale capside en hoe de keuze van genotypen de opname en daaropvolgende subcellulaire sortering beïnvloedt. We beschrijven hoe het begrijpen van capside-eigenschappen, zoals stabiliteit tijdens het binnenkomstproces, het lot van de binnenkomende deeltjes kan veranderen en hoe dit zich vertaalt in verschillen in immuniteitsuitkomsten. We bespreken in detail hoe het muteren van het membraanlytische capside-eiwit VI de sortering na binnenkomst van soorten C-virussen beïnvloedt en bespreken kort of dergelijke benaderingen een bredere implicatie zouden kunnen hebben bij de ontwikkeling van vaccins en/of vectoren.

Klik pure cistancheProduct

For more information:1950477648nn@gmail.com

1. Inleiding

Virale infecties blijven, in tegenstelling tot bacteriële infecties die met antibiotica kunnen worden behandeld, een bedreiging voor de gezondheid, aangezien er maar heel weinig antivirale middelen bestaan. Daarom is vaccinatie de enige algemeen toepasbare strategie om menselijke (en dierlijke) populaties te beschermen tegen virale infecties.

Vaccinatie tegen virusinfecties werd tot voor kort vooral beschouwd in het kader van het voorkomen van kinderziektes of als de jaarlijkse griepprik ter voorkoming van griepinfecties. Met het uitbreken van de SARS-CoV-2-gezondheidscrisis in 2020 is vaccinatie weer in het middelpunt van de publieke belangstelling komen te staan, aangezien het nu wordt gezien als de enige duurzame uitweg uit deze pandemie. In deze context zijn op adenovirus (Ad) vector gebaseerde vaccins naar voren gekomen als een van de twee belangrijkste succesvolle vaccinatiestrategieën. Na noodgoedkeuring worden nu Ad-vaccins geïnjecteerd in een groot deel van de wereldbevolking in een ongekende poging om planetaire immuniteit tegen SARS-CoV op te bouwen-2.

Adenovirus-vectorvaccins werden niet veel gebruikt vóór de uitbraak van COVID-19, maar het succes ervan is niet onverwacht. Virussen zijn over het algemeen zeer geschikte vaccinplatforms. Ze zijn biologisch geoptimaliseerd en aangepast voor transport van nucleïnezuren en wekken immuunreacties op. Adenovirussen hebben veel kenmerken waardoor ze bijzonder ideale vaccinkandidaten zijn. Ze hebben een laag en goed gekarakteriseerd pathogeen profiel gecombineerd met een hoge besmettelijkheid. Ze zijn technologisch benaderbaar en zijn op grote schaal gebruikt voor vectorisatie. Hun hoge productieopbrengst en stabiliteit maken industriële productie mogelijk onder goede fabricagepraktijken (GMP) en bieden praktische kenmerken (dwz opslag) voor regionale distributie tegen lagere kosten [1]. Bovendien is de afgifte van ad-cellen aan antigeenpresenterende cellen efficiënt en wekken ze op natuurlijke wijze een aangeboren immuunrespons op die fungeert als een adjuvans om het vaccinatiesucces te vergroten [2,3].

Het begrijpen van advertentiebiologie is cruciaal geweest bij het ontwikkelen van op advertenties gebaseerde (vaccin)vectoren. Het gebruik van niet-menselijke of zeldzame Ad-serotypen in sommige van de momenteel op de markt gebrachte SARS-CoV-2-vaccins is bijvoorbeeld bewust gekozen om te voorkomen dat reeds bestaande vectorimmuniteit de efficiëntie van het vaccin vermindert. Het gebruik van virale gen-verwijderde vectoren zorgt voor verbeterde vectorveiligheid. Er zijn echter nog steeds veel aspecten van de virale levenscyclus waarmee geen rekening is gehouden bij het ontwikkelen van op advertenties gebaseerde vaccinvectoren, en de kennis over zeldzame of niet-menselijke genotypen is beperkt, inclusief de genotypen die momenteel worden gebruikt als SARS-CoV-2-vaccins . Met deze beoordeling willen we mensen bewust maken van mogelijke aanpassingen die kunnen worden gebruikt bij het ontwikkelen van advertentievectoren voor medische doeleinden, waaronder vaccinatie.

We richten ons op de virale capside en hoe de keuze van genotypen de opname en daaropvolgende subcellulaire sortering beïnvloedt. We beschrijven hoe het begrijpen van capside-eigenschappen zoals stabiliteit tijdens het binnenkomstproces het lot van de binnenkomende deeltjes kan veranderen en welke verschillende immuniteitsuitkomsten worden waargenomen. Als een voorbeeld van hoe de stabiliteit en het lot van capside kunnen worden veranderd, bespreken we in detail hoe het muteren van het membraanlytische capside-eiwit VI soorten C-virussen beïnvloedt. Ten slotte bespreken we kort of dergelijke benaderingen het potentieel hebben om te worden benut voor de ontwikkeling van vaccins en/of vectoren.

1.1. Adenovirussen vormen een diverse familie van besmettelijke ziekteverwekkers

Historisch gezien werd Ad voor het eerst geïsoleerd in 1953 uit adenoïden van patiënten met luchtweginfecties [4], en kort daarna werd de term "adenovirus" algemeen aanvaard [5]. De familie van Adenoviridae heeft meer dan 120 leden, verdeeld in vijf geslachten, afhankelijk van of ze zoogdieren (bijv. Mastadenoviridae), vogels (bijv. Aviadenoviridae), reptielen (bijv. Atadenoviridae), amfibieën (Siadenoviridae) of vissen (Ichtadenoviridae) infecteren. ) [6,7]. Het geslacht Mastadenoviridae is ook verantwoordelijk voor meer dan 70 soorten menselijke advertenties [8,9], die zijn geclassificeerd in zeven soorten (A-G), volgens hun morfologische, biologische en fysisch-chemische eigenschappen, zoals vermeld in tabel 1 [10, 11].

Bovendien kunnen Ads ook spontaan recombineren, waardoor nieuwe soorten worden gegenereerd [12], zoals het geval was voor AdE4, het enige E-virus van de menselijke soort en waarschijnlijk het resultaat is van de recombinatie tussen menselijke soort B en een aap Ad [13 ]. Hoewel infecties bij mensen met niet-menselijke advertenties van nature zeldzaam zijn, zijn ze niet onmogelijk [14,15]. Het vermogen van een verscheidenheid aan niet-menselijke advertenties om menselijke cellen te infecteren (of transduceren), maakt ze aantrekkelijke (vaccin) vectorplatforms. Onder hen zijn advertenties die zijn afgeleid van chimpansees [16–18], gorilla's [19], schapen [20], koeien [21], honden [21,22] of de aap uit de nieuwe wereld [23].

Adenovirusinfecties kunnen verschillende pathologieën veroorzaken, afhankelijk van hun cellulaire of weefseltropisme, waaronder ademhalings-, oog-, urine- of gastro-intestinale aandoeningen (zie tabel 1). Weefseltropisme is vaak het resultaat van verschillend receptorgebruik door verschillende advertenties en kan ook verband houden met intrinsieke deeltjesstabiliteit [24]. De meeste infecties met advertenties zijn mild of asymptomatisch bij een immuuncompetente gastheer. Primaire Ad-infecties komen meestal voor tijdens de kindertijd en resulteren in een sterke beschermende immuniteit. Daarentegen kunnen advertenties bij individuen met een onderdrukt immuunsysteem ongecontroleerde, ernstige en levensbedreigende systemische infecties veroorzaken die leiden tot ernstige celtoxiciteit, wat kan leiden tot overmatige ontsteking en meervoudig orgaanfalen, met een hoge mortaliteit tot gevolg [12].

De best bestudeerde menselijke advertenties zijn de soorten C-virussen type 2 en 5, die voornamelijk worden aangetroffen bij patiënten met infecties van de bovenste luchtwegen en gastro-intestinale infecties [25] en die de belangrijkste focus van deze review zullen zijn. Adenovirussen kunnen verantwoordelijk zijn voor incidentele uitbraken, zoals virussen van soort B die longontsteking veroorzaken (bijv. Ad3, 7 en 14) bij immuuncompetente individuen [26] of Ad40/41 van soort F en Ad12, 18 en 31 van soort A , die het maagdarmkanaal infecteren (zoals besproken in [26,27]). Soort D-virussen vormen een zeer diverse groep en zijn vatbaar voor recombinatie en zijn een belangrijke oorzaak van ooginfecties [28].

1.2. Adenovirus-capsiden zijn metastabiele structuren

Ondanks hun diversiteit volgen alle advertenties een vergelijkbaar structureel en organisatorisch raamwerk. Adenovirussen zijn niet-omhulde DNA-virussen die een relatief groot, 26-45 kb lineair dubbelstrengig DNA-genoom bevatten [29-31]. De capside heeft een diameter van ~70-90 nm en heeft de vorm van een icosaëder met 20 facetten en 12 hoekpunten [32]. De capside bestaat uit drie belangrijke structurele eiwitten (hexon, penton en fiber) en een verscheidenheid aan kleinere cementeiwitten (dwz IIIa, VI, VIII en IX in soorten C-virussen) die de structuur stabiliseren. De structuur met hoge resolutie van verschillende Ad-capsiden is verkregen door cryo-elektronenmicroscopie en röntgenkristallografie [24,33-36]. De icosaëdrische capside heeft een pseudo-T25-structuur met 720 exons geassembleerd in verschillende trimeren, afhankelijk van hun locatie in de capside. De 20 facetten van de capside zijn samengesteld uit negen geassembleerde exons (de zogenaamde GON voor Group of Nine), terwijl op de 12 hoekpunten exons zijn geassembleerd in GOS (voor Group of Six) (zie [37,38] voor meer details ). De pentamere pentonbasis wordt in de 12 hoekpunten gestoken en dient als basis voor de uitstekende trimere vezel [39,40]. De interactie tussen grote en kleine capside-eiwitten stabiliseert de capside, voornamelijk door de interactie met zeshoeken.

GON wordt bijvoorbeeld gestabiliseerd door IX [41]; IX en IIIa worden zelf gestabiliseerd door hun interactie met VIII, die hen verbindt met respectievelijk GOS en GON [37]. VIII-moleculen schetsen de GON en helpen zeshoeken aan de binnenkant van de capside te stabiliseren. Eiwit VI stabiliseert ook hexon door de centrale holte van het hexon-trimeer te binden die is blootgesteld aan het binnenste virale lumen [42-44].

De capside omringt en beschermt de virale kern die bestaat uit het virale genoom, de virale kerneiwitten (dwz V, VII, Mu in soorten C-virussen) en het terminale eiwit (TP), dat covalent is gebonden aan elk 5'-uiteinde van het Ad-genoom. Kleine capside-eiwitten interageren met kerneiwitten die een verbinding tot stand brengen tussen capside en genoom; hun ruimtelijke organisatie tussen de kerneiwitten blijft echter slecht begrepen. Het is aangetoond dat V DNA in de capside houdt door interactie met VI (capside-zijde) en VII (genoomzijde) [45-47] en waarschijnlijk bijdraagt ​​​​aan het vrijkomen van het genoom bij de nucleaire porie [48]. VII is het belangrijkste capside-eiwit geassocieerd met viraal DNA en bevordert de condensatie ervan in de capside [49-51]. VII beschermt ook het virale genoom tegen immuundetectie door cellulaire factoren [50,52-54]. Interessant is dat capside-eiwit IX en eiwit V alleen aanwezig zijn in Mastadenoviridae [55,56], en virale capsiden kunnen worden geproduceerd zonder IX [57] of eiwit VII [58], wat enige flexibiliteit in de capside-structuur laat zien.

Het genoom van menselijke Ads codeert voor ~45 eiwitten (inclusief de structurele eiwitten), georganiseerd in tijdelijk gereguleerde transcriptie-eenheden [59]. De transcriptiefactor E1A is het eerste tot expressie gebrachte eiwit en is nodig om virale genexpressie te initiëren [60]. Het genoom herbergt ook een 5'-inkapselingssequentie en omgekeerde terminale herhalingen (ITR) aan elk uiteinde die nodig zijn voor replicatie [59,61-64]. Adenovirussen coderen voor een adenoviraal protease (AVP) dat in het deeltje is gepakt en verschillende eiwitten verwerkt (dwz IIIa, VI, VII, VIII, µ, TP en 52.55K in soorten C-virussen) [65-67]. Deze stap is vereist voor de vorming van volgroeide infectieuze deeltjes en induceert de vorming van metastabiele (dwz minder stabiele) capsiden die klaar zijn voor demontage van de capside na celhechting en binnenkomst [68,69]

Er zijn ook soortspecifieke verschillen in de structuur van menselijke advertenties, bijvoorbeeld in de vezellengte en flexibiliteit, die rechtstreeks van invloed zijn op receptorbinding [70-72]. Verschillen zijn ook waar te nemen in penton-assemblage. Pentons van soorten B-virussen kunnen contacten tussen pentonen vormen, wat resulteert in alternatieve en minder stabiele virusachtige deeltjes die geen genomen hebben en soms zonder vezels. Dergelijke deeltjes worden dodecaëders genoemd en worden bestudeerd voor de celoverdracht van plasmiden of peptiden als alternatief voor Ad-vectoren. Dodecaëders leggen beter een RGD-kort peptide-motief bloot dat aanwezig is in de penton van de meeste Ad-soorten, dat nodig is om doelcellen te binden [73,74]. Verschillen in capside-stabiliteit, zoals hieronder besproken, kunnen een belangrijke eigenschap zijn die het lot van Ad-deeltjes bij binnenkomst bepaalt.

1.3. Adenovirussen volgen een lytische levenscyclus

De advertentie-infectiecyclus is elders uitgebreid besproken [75-77]. Hier concentreren we ons kort op het ingangsgedeelte van de levenscyclus en, tenzij anders vermeld, verwijzen we naar soorten C-virussen, die het best zijn bestudeerd (Figuur 1). Adenovirussen gebruiken capside-vezels als het primaire celhechtingsmolecuul. De meeste advertenties, inclusief soorten C-virussen, gebruiken het coxsackievirus en de advertentiereceptor (CAR) om doelcellen te binden [78-81]. Daarentegen binden sommige soorten B-virussen bij voorkeur aan de CD46-receptor [82] of desmogleïne 2 [83], en sommige soorten D-virussen bleken een interactie aan te gaan met siaalzuren [84,85] of rechtstreeks met v-integrinen (zie tabel 1) [ 86].

Het wisselen van vezels tussen soorten is dus een aantrekkelijke strategie om tropisme te veranderen [87-89]. De primaire rol van het vezelmolecuul is het bemiddelen van de fysieke associatie met doelcellen, die wordt gevolgd door een tweede interactie tussen penton en integrinen, zoals v 5 [90]. Deze interactie wordt gemedieerd door het RGD-peptidemotief in de pentonsequentie [91]. De afwezigheid van dit motief, zoals bij soorten F-virussen, wordt geassocieerd met een minder efficiënte celinvoer [92]. Integrinebinding resulteert in integrineclustering aan het celoppervlak [93] die een signaalcascade in gang zet, wat leidt tot de reorganisatie van het actine-cytoskelet [94,95] en de endocytische opname via clathrin-gemedieerde endocytose of micropinocytose [96,97]. RGD-binding kan ook de capside destabiliseren [98] door de contacten tussen penton en hexon te verminderen, waardoor de capside wordt ontkleed [99]. Als gevolg hiervan verliezen Ad-deeltjes hun vezel en kan men gedissocieerde hexon en penton in het endosoom vinden [100-102]. Het endosoom is een dynamisch organel dat klaar is om te rijpen tot afbrekende lysosomen, en advertenties moeten snel ontsnappen naar het cytosol. Endosoomverzuring kan het ontsnappingsproces versnellen door de capside verder te verzwakken [100,103]. Het penetratieproces van het endosoom is afhankelijk van het vrijkomen van het interne capside-eiwit VI [103,104].

De vrijgegeven VI wordt gekenmerkt door een N-terminale amfipathische helix die zich bindt aan de binnenste folder van het endosoom en een positieve membraankromming induceert, resulterend in lokaal ingesloten membraanruptuur [75,103,105,106]. Cellen reageren op de virus-geïnduceerde membraanbreuk en activeren een gelokaliseerde autofagie-reactie om het beschadigde organel te verwijderen [107-109]. Om afbraak te voorkomen, blokkeren Ads autofagie via een kort PPxY-peptidemotief in proteïne VI totdat het deeltje de veiligheid van het cytosol heeft bereikt [104,108]. Soort C-virussen bleken te ontsnappen uit vroege endosomen [110]. Andere soorten, waaronder A, B en D, gaan eerst naar het lysosoom voordat ze in het cytosol ontsnappen [111-113], wat de immuunactivatie veroorzaakt door die virussen kan beïnvloeden [114].

Zodra advertenties het cytosol hebben bereikt, werken ze samen met dyneïne-motoren en gebruiken ze retrograde transport langs microtubuli om het organiserende centrum van de microtubuli te bereiken [115-117]. Motorbinding wordt waarschijnlijk gemedieerd door hexon [115] en kan zure priming vereisen [118]. In de buurt van de kern veranderen capsiden van transportrichting, waarschijnlijk door zich te binden aan kinesin-motoreiwitten en zich op te hopen bij de nucleaire envelop [115,117,119,120]. Ze meren aan bij het kernporiëncomplex, vervolgens worden capsiden volledig gedemonteerd en genomen worden vrijgegeven en geïmporteerd in de kern [51,121-124]. Eenmaal in de kern gaat de cyclus verder door transcriptieactivering van het genoom en expressie van het directe vroege E1A-gen, dat dient als een transcriptiefactor voor alle andere vroege transcriptie-eenheden [60,125-130]. Na de expressie van de replicatie-enzymen worden virale genomen gerepliceerd en hopen zich op aan de periferie van replicatiecentra [131].

Vervolgens worden structurele eiwitten tot expressie gebracht vanuit de late expressie-eenheid onder controle van de belangrijkste late promoter [132,133]. Expressie van late genen culmineert in de productie en nucleaire accumulatie van alle structurele eiwitten, waar ze zich assembleren tot nageslacht en nieuw gesynthetiseerde genomen verpakken. Nucleaire assemblage van de volgende generatie advertenties resulteert vervolgens in het uittreden van deeltjes en cellysis [42,134–136]. Zoals hierboven vermeld, wordt de assemblage van de capsides gevolgd door rijping, dwz de proteolytische splitsing van verschillende capside-eiwitten door de AVP om infectieuze deeltjes te produceren [66]. Het belang van dit proces wordt geïllustreerd door de temperatuurgevoelige mutant, Ts1, aanvankelijk geïdentificeerd in een mutagenesescherm in Ad2. Bij de niet-tolerante temperatuur slaagt deze mutant er niet in om de AVP te verpakken, en geassembleerde deeltjes ondergaan geen rijping, wat resulteert in hyperstabiele deeltjes [137]. De verantwoordelijke AVP-mutatie werd genetisch geïntroduceerd in Ad5 met behoud van dit fenotype. Ts1-capsiden kunnen zich nog steeds hechten aan celreceptoren en worden geëndocyteerd, maar blijven dan gevangen in het endosoom omdat ze er niet in slagen eiwit VI vrij te maken [103,138,139].

2. Immuundetectie van adenovirus

Adenovirussen zijn wijdverbreid en een grote meerderheid van de bevolking is met dit virus geconfronteerd, voornamelijk tijdens de kinderjaren. Adenovirussen zijn zeer immunogeen en elke ontmoeting veroorzaakt de ontwikkeling van specifieke anti-Ad-immuniteit, zowel aangeboren als adaptief, die een leven lang kan duren. Dit is belangrijk in de strijd tegen het virus en maakt Ads minder schadelijk voor de immuuncompetente gastheer, maar kan een obstakel vormen wanneer Ads als vector in vaccinologie of gentherapie worden ingezet [140,141]. Door te begrijpen hoe Ad (en zijn vectorderivaten) het immuunsysteem activeert, kunnen we de effectiviteit en veiligheid van vaccins verbeteren. Waarnemingen in vivo, van patiënten die deelnamen aan klinische onderzoeken, toonden duidelijk aan dat op advertenties gebaseerde vectoren krachtige immuunactivatie kunnen induceren [142,143], soms met fatale gevolgen [144].

Bovendien suggereren verschillende onderzoeken die in vitro of diermodellen zijn uitgevoerd [145] een sleutelrol van het virale deeltje zelf (dwz capside en ingebouwd DNA) bij het activeren van de initiële immuunrespons. Hier concentreren we ons kort op immuunresponsen geassocieerd met de binnenkomende capside; voor een meer diepgaand overzicht, zie eerder gepubliceerde recensies [146–149].

2.1. Adenovirussen activeren de intrinsieke immuniteit van cellen

Met de ontwikkeling van advertenties als vectoren werd het duidelijk dat celintrinsieke of aangeboren immuniteit die door advertenties wordt veroorzaakt, een reactie is op het binnendringende virion. Interessant is dat zowel replicatieve als niet-replicatieve virussen (dwz UV-geïnactiveerde virussen, niet-replicatieve vectoren of lege capsiden) immuunresponsen in de geïnfecteerde cellen activeren, wat aantoont dat de capside een sleutelrol speelt in deze reactie [145,150-156]. .

Over het algemeen worden advertenties door cellen waargenomen in verschillende stappen gedurende de gehele levenscyclus van het virus en activeren ze aangeboren immuniteitsroutes (Afbeelding 1). Deze activering begint met de Ad-vezelbinding aan de celoppervlakreceptor CAR, die de mitogeen-geactiveerde proteïnekinase (MAPK) -signalering activeert die leidt tot de activering van de transcriptiefactor NF-KB. Deze trigger resulteert in de productie van pro-inflammatoire cytokines (IL-6, IL-8) [157,158]. Afhankelijk van de Ad-soort kan het gebruik van andere receptoren echter de sterkte van de signaalcascade die betrokken is bij cytokine-expressie moduleren [159]. De interactie tussen viraal penton en cellulair integrine is een verdere trigger van immuunactivatie. Een studie in muriene macrofagen toonde aan dat deze binding de expressie van IL-1 activeert via het RGD-motief [160]. Dit is mogelijk beperkt tot immuuncellen omdat in andere celmodellen (bijv. HeLa, lijn van epitheelcellen) de rol van de integrine/RGD-interactie bij de productie van chemokines en pro-inflammatoire cytokines niet werd bevestigd [151,161,162]. Dit suggereert een belangrijkere rol van het internalisatieproces zelf bij immuunactivering dan de interactie met integrines. Pentonbinding aan integrine activeert inderdaad ook de fosfoinositide 3-kinase (PI3K)-signalering om virale internalisatie te vergroten [163].

Bovendien is aangetoond dat PI3K-activering bij Ad-infectie de productie van pro-inflammatoire cytokines activeert, zoals TNF [164], en het internalisatieproces is beschreven als vereist voor immuunactivering [165]. Deze onderzoeken suggereren dat immuunactivatie voornamelijk plaatsvindt in een post-internalisatiestap, wat het belang van sortering na binnenkomst benadrukt (besproken in [166]).

Eenmaal in het endosoom worden advertenties blootgesteld aan intraluminale pathogeenherkenningsreceptoren (PRR) zoals TLR9, een dubbelstrengs DNA-sensor die beperkt is tot immuuncellen. Muizenmacrofagen kunnen via TLR9 advertentievectoren detecteren om de productie van pro-inflammatoire cytokines te induceren [167]. TLR9 was ook strikt vereist voor IFN/-productie wanneer muriene plasmacytoïde dendritische cellen (pDC) werden uitgedaagd met Ad [168]. In TLR9 knock-out muismodellen werd IFN/ echter nog steeds geproduceerd, wat suggereert dat in andere cellen dan pDC IFN-productie onafhankelijk van TLR9-signalering plaatsvindt [168,169].

Virale genomen (of vectorgenomen) worden toegankelijk voor detectie tijdens of na de endosomale ontsnapping van het virus. Zodra ze het cytosol bereiken, worden ze waargenomen door de cytosolische dubbelstrengige DNA-sensor cGAS [168,170]. Na virale genoomherkenning bevordert cGAS fosforylering en nucleaire translocatie van de transcriptiefactor IRF3 om IFN / expressie aan te sturen, waardoor een antivirale toestand wordt geïnduceerd. Endosomale passage vereist door virus geïnduceerde endosomale membraanbeschadiging om de endosomale ontsnapping van virale deeltjes te vergemakkelijken. Membraanbreuk draagt ​​dus aanzienlijk bij aan immuunactivering, benadrukt door het feit dat de ontsnappingsdefecte Ts1-mutant er niet in slaagt een volledige en efficiënte immuunrespons te activeren [161,162,170,171]. Een cruciale rol in de ontstekingsreactie na penetratie van het Ad-membraan wordt gespeeld door het tankbindende kinase, TBK1, waarvan wordt gesuggereerd dat het deel uitmaakt van stroomafwaartse cytosolische detectie van het virale genoom via de cGAS/STING-route [168,170].

Adenovirusmembraanbeschadiging resulteert ook in het vrijkomen van cathepsine B uit het endo-lysosomale compartiment, wat oxidatieve stress veroorzaakt, die het NLRP3-ontstekingsmasker activeert, wat resulteert in IL-1 rijping [114]. Soort C-virussen ontsnappen uit vroege endosomen, terwijl soorten B-virussen zich verplaatsen tot late endosomen, vermoedelijk als gevolg van verschillen in receptorgebruik. Verzuring in het late endosoom/lysosoom activeert eerder lysosomale zure hydrolasen. Beide soorten induceren ontstekingsactivatie [172], maar, waarschijnlijk vanwege de verblijftijd in het endosoom, verschilt de mate van hun reacties. Wereldwijd induceren soorten B-virussen een sterkere aangeboren en adaptieve immuunactivatie dan soorten C-virussen [113,173,174]. Dit zou kunnen verklaren waarom soorten B-virussen meer pathogeen zijn en uitbraken veroorzaken bij immuuncompetente gastheren [26]. Het suggereert verder dat cellen het penetratiecompartiment (dwz endosoom vs. lysosoom, [109]) kunnen onderscheiden en de efficiëntie van immuniteit kunnen aanpassen. Endosomale membraanbeschadiging tijdens het Ad-ontsnappingsproces kan op zichzelf ook een gevaarsignaal zijn. Zoals hieronder in detail wordt besproken, resulteert membraanbeschadiging in de cytosolische blootstelling van intraluminale glycanen, die door de cel worden gedetecteerd als gevaarsignalen (zoals besproken in [109]). De detectie van blootgestelde glycanen door galectines activeert vervolgens autofagie, waardoor een tweede tak van antivirale immuniteit wordt geactiveerd [108].

2.2. Adenovirussen lokken een adaptieve immuunrespons uit en ondermijnen antivirale autofagie bij binnenkomst in de cel

Aangeboren immuunresponsen uitgelokt door Ads of hun vectoren vertalen zich vervolgens in adaptieve immuniteit door middel van chemokinesecretie die immuuncellen (neutrofielen, natuurlijke killercellen en macrofagen) aantrekt en krachtige antigeenpresentatie versterkt [153,154]. Adenovirussen zijn zeer immunogeen en hun belangrijkste immunogenen zijn de belangrijkste capside-eiwitten (hexon, penton en fiber) die de soortspecifieke productie van neutraliserende antilichamen door B-cellen op gang brengen [175-177].

Neutraliserende antilichamen zijn meestal gericht tegen de hypervariabele lussen van het hexon-eiwit [178-180] en vormen een belangrijke beperking voor het gebruik van advertenties als vectoren die zijn afgeleid van hetzelfde serotype. Dit probleem is omzeild door het gebruik van minder seroprevalente of niet-menselijke advertenties [181-185]. Ondanks deze antivectorimmuniteit induceren advertenties, wanneer ze worden gebruikt als vaccinplatforms (bijvoorbeeld om immuunbescherming tegen ebola op te wekken in klinische onderzoeken), nog steeds een sterke B-celrespons, waardoor de productie van antilichamen tegen het gewenste vaccinimmunogeen mogelijk wordt gemaakt. voor maximaal 6 maanden [186]. Bovendien zou reeds bestaande vectorimmuniteit kunnen worden overwonnen met hogere vaccinvectordoses, zoals in het geval van de SARS-CoV{11}}-vaccinvector op basis van de hoge seroprevalentie AdC5 [187].

Net als bij neutraliserende antilichamen veroorzaken advertentie-infecties een aanhoudende T-celimmuniteit, voornamelijk door CD4 plus-activering. Deze bescherming is nog steeds te vinden bij volwassenen, wat wijst op een langdurige immuniteit vanaf de kindertijd [188-190]. Daarnaast wordt activering van CD8 plus ook beschreven om een ​​cytotoxische respons te handhaven [191-193]. Deze T-celactivering is niet noodzakelijkerwijs serotypespecifiek en maakt kruisbescherming mogelijk tegen verschillende Ad-subgroepen en serotypen [192-194].

Bovendien is bij met Ad geïnfecteerde stamcelgetransplanteerde patiënten een sterke activatie van CD4 plus en CD8 plus beschreven [195]. Deze activatie is gericht tegen hexonpeptiden en leidt tot klaring van ad-viremie, wat de belangrijke rol van zowel CD4 plus- als CD8 plus T-celactivering bij immuunbescherming benadrukt. Hoewel deze op T-cellen gebaseerde immuniteit gericht is tegen het Ad-deeltje, veroorzaken advertenties ook sterke cellulaire immuniteit op basis van de Tcell-respons tegen het vaccinantigeen, wat een voordeel is voor langdurige immuniteit bij gebruik van recombinante Ad-vectoren als vaccinplatforms [196,197 ]. Belangrijk is dat gegevens uit klinische onderzoeken hebben bevestigd dat wanneer Ad wordt gebruikt als een vaccinplatform (met het gewenste antigeen als een transgen), het zowel cytotoxische CD8 plus T-cel- als CD4 plus T-celactivering induceert, wat leidt tot geheugenimmuniteit tegen de tot expressie gebracht transgen [184,186,198-202].

T-celactivering is afhankelijk van de presentatie van virale peptiden via het major histocompatibility complex (MHC). In het kort, antigeenpresentatie door MHC klasse I is het resultaat van proteasomale afbraak, en de verkregen peptiden zullen CD8 plus T-celactivering induceren, waardoor priming en proliferatie van een cytotoxische T-celrespons mogelijk wordt. Presentatie van MHC klasse II-antigeen is het resultaat van lysosomale proteolyse, en de resulterende peptiden zullen bij presentatie CD4 plus T-celactivering induceren, waardoor de daaropvolgende activering van B-cellen wordt geactiveerd [203]. Het is nu goed gekarakteriseerd dat autofagie de presentatie van peptiden aan de MHC klasse II-moleculen bevordert [204]. Het is niet verrassend dat autofagie een van de oudste verdedigingsmechanismen tegen infectie is en een belangrijk onderdeel van het cellulaire repertoire tegen binnendringende ziekteverwekkers, en dat het deelneemt aan zowel aangeboren als adaptieve immuunresponsen. Het kan direct een ziekteverwekker afvangen voor afbraak (xenofagie) en neemt deel aan de presentatie ervan aan het immuunsysteem [205-207]. Macroautofagie (beter bekend als autofagie) is een geconserveerde lysosomale afbraakroute die deelneemt aan veel fundamentele fysiologische processen zoals homeostase en aangeboren en adaptieve immuniteit [208-210]. Autofagie wordt gekenmerkt door de vorming van een dubbelmembraanblaasje genaamd "autofagosoom" dat cytoplasmatische ladingen (dwz organellen, aggregaten en pathogenen) overspoelt die bestemd zijn voor afbraak (Figuur 2). Tijdens dit proces fuseren ladingbevattende autofagosomen met lysosomen om te worden afgebroken en gerecycled.

Antigeenpresentatie via autofagie is beschreven voor zowel MHC klasse I als klasse II [204]. Na inductie van autofagie worden intracellulaire antigenen verzwolgen in autofagosomen, die fuseren met MHC klasse II-bevattende compartimenten om ze te voorzien van extern pathogeenmateriaal (Figuur 2) [211]. De rol van autofagie in deze specifieke MHC klasse II-antigeenpresentatie werd voor het eerst beschreven voor Epstein-Barr-virusinfectie, waarbij remming van autofagie leidde tot verminderde CD4 plus T-celactivering [212,213]. Tot op heden zijn er voorbeelden van verschillende virussen, waaronder het herpes simplex-virus [214], het influenzavirus [215] en het humaan immunodeficiëntievirus type 1 (hiv-1) [216], en dit geldt waarschijnlijk ook voor advertenties (zie hieronder). MHC klasse II-presentatie is consistent met het proces van autofagie, aangezien het een cytosolisch afweermechanisme is. Autofagie is ook betrokken bij de kruispresentatie van MHC klasse II van extracellulaire antigenen [214]. De MHC-presentatie van extracellulair ovalbumine is inderdaad efficiënter wanneer de autofagie-machinerie (en vooral ATG5) functioneel is, en er is aangetoond dat de opname van extracellulair materiaal een niet-canonieke vorm van autofagie betreft die LC{17}}geassocieerde fagocytose wordt genoemd ( LAP) [217].

Eenmaal aanwezig in de LAP-some, kunnen sommige extracellulaire antigenen worden blootgesteld via MHC klasse II-presentatie [218]. Autofagie is ook tot op zekere hoogte betrokken bij de presentatie van MHC klasse I, hoewel de overgrote meerderheid van de epitopen wordt gepresenteerd via een mechanisme dat strikt afhankelijk is van de transporter die geassocieerd is met het antigeenverwerkingscomplex (TAP) [219]. TAP-onafhankelijke presentatie gemedieerd door autofagie werd tot nu toe alleen getoond onder omstandigheden van TAP-uitputting [219,220]. Of deze manier van presenteren echt bestaat, blijft controversieel [221] en wordt elders besproken [204,222,223].

Om MHC-presentaties te voorkomen, wijden advertenties een groot deel van hun genoom, namelijk het E3-gebied, aan het ondermijnen van het MHC-presentatiesysteem in cellen [224-228]. In de meeste (vaccin)vectoren zijn deze genen afwezig, en recent werk suggereert dat toenemende antigeenpresentatie door MHC de efficiëntie van het Ad-vaccin zou kunnen verbeteren [229,230]. Autofagie speelt een cruciale rol bij het verwerken van advertentie-antigenen voor MHC klasse II-presentatie in door advertenties geïnduceerde immuniteit [108,229].

Montespan et al. toonde aan dat advertenties autofagie induceren bij penetratie van het endosoom en dat het binnendringen van deeltjes die door autofagie zijn gewist in dit proces efficiënt wordt gepresenteerd aan het immuunsysteem [108]. Deze observatie komt overeen met de studie gepubliceerd door Klein et al. waaruit blijkt dat in de context van oncolytische advertenties de virale antigenen worden gerijpt door een JNK-afhankelijke vorm van autofagie [229]. Autofagie in de context van kanker speelt echter een dubbele rol. Als een homeostase-bewaarder beperkt autofagie de initiatie van tumoren [231] terwijl autofagie in vergevorderde kanker fungeert als een overlevingsproces om tumorgroei te bevorderen [232,233]. In de context van oncolytische vectoren moeten tumorspecifieke autofagiekenmerken dus zorgvuldig worden geëvalueerd.

3. Adenovirussen als (vaccin)vectoren

Vectorisering van een virus omvat de exploitatie van zijn natuurlijke eigenschappen, terwijl tegelijkertijd het bijbehorende biologische risico wordt geminimaliseerd. In deze termen zijn advertenties uitstekende vectorkandidaten voor de ontwikkeling van vaccins [234]. Adenovirusvectoren zijn stabiel, gemakkelijk te produceren tot een hoge titer en hebben een grote kloneringscapaciteit. Dit maakt de insertie van een transgen mogelijk, dwz om een ​​antigeen naar keuze tot expressie te brengen. Ze hebben een breed infectiviteitsspectrum en transduceren niet-delende cellen, en hun genoom is niet-integratief [1]. Zoals hierboven beschreven, veroorzaken ze ook een ontstekingsreactie in antigeenpresenterende cellen (APC's) die een adjuvante functie hebben om de immuunrespons te versterken die nodig is om efficiënt te vaccineren [2,3,142,235,236].

Bovendien zijn van Ad afgeleide vectoren uitgebreid gebruikt in preklinische en klinische onderzoeken om hun veiligheid te bewijzen [237,238]. Om het ongewenste deel van de replicatiecyclus te elimineren, moet virale replicatie worden onderdrukt om cellysis en virale verspreiding te voorkomen. De ontwikkeling van adenovirusvectoren begon begin jaren negentig als een platform voor een groot aantal therapeutische benaderingen, zoals gentherapie, oncolytische vectoren en de ontwikkeling van vaccins. De meeste vroege vectorontwikkelingen waren gemodificeerde versies van soorten C-virussen.

3.1. Adenovirus-vectorontwikkeling, een generatiebenadering

De eerste generatie van een Ad-vector werd gemaakt door de E1- en E3-regio uit het virale genoom te verwijderen, met name coderend voor de onmiddellijke vroege transcriptiefactor, waardoor wordt voorkomen dat deze vectoren repliceren. Deze vectoren hadden een kloneringscapaciteit van ongeveer 8 kb om een ​​transgen met regulerende sequenties in te voegen [239-241]. De vectoren van de eerste generatie werden geproduceerd in menselijke embryonale niercellen (HEK) die stabiel waren getransformeerd met een deel van het Ad5-virale genoom dat het El-gebied in trans aanvult [242-247]. Een van de belangrijkste nadelen van dit systeem is dat het de reconstitutie van replicatie-competente genomen mogelijk maakt na spontane recombinatie [248]. De extra deletie van E3, die niet nodig is voor vectorproductie, vergroot de grootte van de transgencassette [243] en bevordert een betere immuunrespons [240].

Helaas waren Ad-vectoren van de eerste generatie niet volledig transcriptioneel inert en wekten nog steeds een sterke immuunrespons op tegen virale capside-eiwitten die tot expressie werden gebracht op basislijnniveaus [141,249,250]. Deze lentivectorimmuniteit droeg bij aan vectortoxiciteit en de eliminatie op korte termijn van getransduceerde cellen [145]. Bij de tweede generatie Ad-vectoren werden bovendien de E2- en E4-regio's uit het vectorgenoom verwijderd. E2 codeert voor de replicatie-enzymen en E4 aanvullende regulerende eiwitten [251-253]. Hierdoor was er ruimte voor 10,5 kb aan transgene sequenties, inclusief maximaal vier expressiecassettes [254]. Evenzo verminderden de aanvullende deleties ongewenste recombinatie en verlengde transgenexpressie sterk [255]. Dit was waarschijnlijk het resultaat van een verminderde afwijkende virale genexpressie die de immuniteit tegen vectoren verder vermindert [141,250,251]. Adenovirale vectoren van de derde generatie zijn conceptueel verschillend. Ze bestaan ​​uit een verpakt vectorgenoom en een niet-verpakt viraal genoom (helpervirus) dat vectordeeltjes produceert. Dergelijke vectoren zijn ook bekend als "helper-afhankelijke", "gutless" of "high-capacity" (HC-Ad) vectoren. Ze hebben de hoogst mogelijke klooncapaciteit en kunnen sequenties tot 36 kb bevatten [256–258]. Advertenties met hoge capaciteit missen enige virale coderende sequentie behalve ITR's en een kort inkapselingssignaal dat genoomverpakking mogelijk maakt en dat afwezig is in het helpervirus [259-262]. Deze strategie heeft ons in staat gesteld om eindelijk de meeste anti-vector immuniteit te overwinnen, waardoor de langdurige expressie van transgenen mogelijk is [263-267]. HC-Ads maken echter geen deel uit van het huidige repertoire van vaccinvectoren.

3.2. Adenovirus als vaccinvector

Alvorens te onderzoeken hoe Ad-vectoren zijn uitgebuit, is het opmerkelijk om te vermelden dat vaccinatie tegen Ad-soorten B-virussen type 4 en type 7 zelf in de vroege jaren zeventig werd ontwikkeld [268]. Dit orale levende vaccin is sinds 2011 verplicht voor militaire rekruten in de VS en heeft de infectiegraad drastisch verlaagd tot vrijwel nul [269-271]. Dit benadrukte de intrinsieke efficiëntie en veiligheid van Ads als vaccin en opende de weg om Ads als vaccinatieplatform te gebruiken. Tot op heden zijn er meer dan 200 op advertenties gebaseerde vaccins in klinische proeven opgenomen [272]. Veel ervan zijn gericht tegen besmettelijke ziekteverwekkers zoals hiv-1 en ebola [230,273,274]. Op adenovirus gebaseerde vaccins zijn niet zonder nadelen. Een recent ontwikkeld anti-HIV-vaccin, gebaseerd op het soort C-virus Ad5, gebruikte een mengsel van vectoren die de HIV-1 gag-, pol- en nef-genen tot expressie brengen [275,276]. De vectoren waren veilig, immunogeen en werden goed verdragen. Helaas moest de resulterende klinische STEP-studie voortijdig worden stopgezet [277-279]. Niet alleen is aangetoond dat dit vaccin geen bescherming biedt tegen HIV-infectie, maar epidemiologische gegevens suggereerden dat vaccinatie met Ad in dit geval het risico op HIV-infectie verhoogde [280-282]. Het hebben van een reeds bestaande immuniteit tegen Ad5 werd geïdentificeerd als een potentiële risicofactor na vaccinatie [283,284]. Deze waarneming werd echter niet bevestigd in vergelijkbare studies [285,286] en blijft mechanistisch onduidelijk [287,288]. Naast hiv zijn er op advertenties gebaseerde vectorvaccins ontwikkeld in de strijd tegen ebola (Ad-EBOV), een terugkerende dreiging in West-Afrika [289]. Alle Ad-EBOV-vaccins gebruiken het ebola-glycoproteïne (GP) als vaccinantigeen. Eerste preklinische onderzoeken bij knaagdieren en primaten gebruikten Ad5 en toonden bescherming gedurende 3 maanden met de productie van neutraliserende antilichamen en CD8 plus activering [273,290-292]. Dit vaccin heeft een fase II klinische proef ondergaan; reeds bestaande immuniteit tegen Ad5 in de gevaccineerde populatie heeft echter geleid tot variatie in het niveau van opgewekte neutraliserende antilichamen [293-297]. Om dit probleem op te lossen, zijn er vaccins ontwikkeld op basis van de minder voorkomende soort D Ad26 [186.298.299].

Ad26 is echter minder immunogeen bij mensen, wat resulteert in verminderde vaccinatie-efficiëntie, en vereiste een prime-boost met behulp van een op mazelenvirus gebaseerd vaccin (MVA). Dit vaccinatieregime heeft fase III klinische studies bereikt [289.300.301]. Het gebruik van niet-menselijke advertentievectoren is ook in ontwikkeling [184]. Het gebruik van chimpansee ChAd3 als een vaccinplatform tegen EBOV toonde bescherming bij knaagdieren en chimpansees [302,303], en klinische onderzoeken waarbij die vectoren werden gebruikt, bevinden zich in verschillende stadia van vooruitgang [17,300,301,304-306].

Tot voor kort waren HIV-1- en EBOV-vaccins de twee belangrijkste voorbeelden van de toepassing van op advertentievectoren gebaseerde vaccins, maar ze zijn niet de enige. Er zijn verschillende pogingen gedaan om Ad-vaccinvectoren in te zetten tegen verschillende pathogenen zoals Mycobacterium tuberculosis [307-310], dengue-virus [311-313], hepatitis B en C [314-320], hondsdolheid [321-324] of griep [325-328]. Hun werkzaamheid was echter altijd onder de verwachtingen (voor meer details, zie [18,142,300,329]). Het EBOV-kandidaat-vaccin is het enige praktisch toegepaste Ad-vaccin gebleven en wordt met enige beperkingen gebruikt in de Democratische Republiek Congo. Dit vaccin is gebaseerd op het Ad26-type (Ad{17}}ZEBOV/MVA-BN-FILO), en in mei 2020 kregen 20.339 mensen de eerste vaccinatiedosis en waren 9560 volledig gevaccineerd [230.301.330].

Adenovirus-gevectoriseerde vaccins hebben een grote publieke impuls gekregen als reactie op de SARS-CoV-2-pandemie. De urgentie van de situatie heeft het mogelijk gemaakt om te profiteren van hun ontwikkeling, inclusief de ervaring die is opgedaan met vaccins tegen coronavirussen die eerdere regionaal beperkte SARS-CoV-1-uitbraken veroorzaakten [331]. Het coronavirus spike (S) glycoproteïne werd geïdentificeerd als het beste vaccinantigeen voor immuniteit tegen coronavirusinfecties [332,333]. Tot op heden bevinden vier Ad-vectorvaccins, die allemaal coderen voor het spike-antigeen, zich in een vergevorderd stadium en zijn in grote delen van de wereld goedgekeurd voor gebruik in noodgevallen. De toegepaste vectorstrategieën waren iets anders, maar omvatten in wezen het gebruik van vectoren van de eerste generatie. Ze variëren van het gebruik van Ad{9}}gebaseerde vectoren op soort C (Ad{10}}nCoV), het overwinnen van reeds bestaande immuniteit met een hoge vectordosis (CanSino) [187,334], tot het gebruik van minder voorkomende soorten D-virus Ad26, met behulp van een gestabiliseerd spike-glycoproteïne (JNJ-78436735/Ad26.COV2.S) [335]. Een alternatieve benadering gebruikt ChAdOx1-S-(AZD1222), een advertentievector van chimpansees [336,337]. Het enige vaccin dat wordt gebruikt op basis van een heterologe prime-boost-strategie om vectorimmuniteit te overwinnen (Gam-COVIDVac/Sputnik V) past eerst een op Ad{26}}gebaseerde vector toe en gebruikt vervolgens in de boosterinjectie een Ad5-vector [338,339]. In alle gevallen waren de gegevens van klinische onderzoeken veelbelovend, met hoge niveaus van geïnduceerde beschermende immuniteit, en in verschillende landen is gebruik in noodgevallen toegestaan ​​voor het gebruik van op advertenties gebaseerde vaccins. Bovendien wijzen epidemiologische onderzoeken van de lopende vaccinatiecampagnes in verschillende landen op een overweldigend succes bij het gebruik van op advertenties gebaseerde SARS-CoV-2-vaccins.

4. Modulerende adenovirus (vaccin) vectorwerkzaamheid, de capsid leidt de weg

Adenovirus (vaccin) vectorontwerp moet rekening houden met verschillende factoren. Deze omvatten het handhaven van een langdurige en aanhoudende expressie van het gecodeerde antigeen en de activering van een immunologische context (adjuvanseffect) die een efficiënte vertaling van de antigeenexpressie mogelijk maakt in een aanhoudende adaptieve immuniteit gericht tegen het immunogeen maar niet tegen de vector zelf. De immunologische context wordt geleverd door de aangeboren immuunactivatie die de vaccinvector opwekt tijdens toediening. In deze context is de efficiëntie waarmee aangeboren immuunsensoren de vector detecteren belangrijk, en deze zal op zijn beurt de amplitude van de adaptieve respons bepalen. Zoals beschreven in de paragrafen hierboven, vindt aangeboren immuundetectie voornamelijk plaats op post-entry-niveau, samen met Ad-endosoompenetratie. De efficiënte expressie van het (vaccin)antigeen hangt dan af van de balans tussen het niveau van vectorklaring vs. succesvolle aflevering en expressie van vectorgenomen aan de kern. Met de ontwikkeling van capside-displayvectoren is expressie van het transgen niet vereist om immuunactivatie op te wekken. Deze strategie is gebaseerd op de insertie van een epitoop van interesse in Ad-capside-eiwitten, waardoor het direct wordt blootgesteld aan het immuunsysteem. Ook al heeft deze aanpak enkele voordelen, de meeste vaccinvectoren vertrouwen op genetisch gecodeerde genen. Voor meer informatie over capside-displayvectoren, zie deze recensies, [340,341].

Reeds bestaande immuniteit tegen een virale vector (bijv. 30-90 procent tegen het soort C-virus Ad5, afhankelijk van de geografische locatie) kan vectoropname verminderen en de antigeenexpressie en de resulterende immuunrespons verminderen [342-344]. Er zijn verschillende strategieën ontwikkeld om de immuniteit tegen vectoren te verminderen en deze zijn onlangs herzien [249]. Kortom, de neutraliserende antilichamen herkennen voornamelijk de hypervariabele lus van exons en zijn bijgevolg serotype-specifiek [178-180]. Deze hypervariabele lussen kunnen daarom worden vervangen door die van een ander, minder voorkomend serotype [178,345]. Dit voorkomt dat de vector wordt geneutraliseerd en geïnactiveerd. Aangezien Ad5 het meest seroprevalente type is, zou het gebruik van zeldzame serotypen zoals Ad26, Ad35 of niet-menselijke advertenties dit probleem ook voorkomen [177,346-350].

Een belangrijk nadeel van het gebruik van zeldzame typen is echter hun lagere immunogeniciteit, waardoor ze minder efficiënt zijn met betrekking tot de ontwikkeling van vaccins [298]. Daarom moeten strategieën om de immuniteit tegen vectoren te verminderen parallel aan strategieën om de vectorimmunogeniciteit te verbeteren worden ontwikkeld om de meest efficiënte vector te verkrijgen. Zelfs als het aanvankelijke niveau van neutraliserende antilichamen tegen de vector laag is, kan vaccinatie met een bepaald vectortype een reactie opwekken die toekomstig gebruik ervan verhindert. Priming van de anti-vectorrespons vindt ook plaats op post-entry-niveau, wanneer vectordeeltjes zelf worden gesorteerd en verwerkt als antigenen. Het opwekken van een immunologisch gunstige context voor vaccinatiesucces kan ten koste gaan van verhoogde priming voor vectorimmuniteit. Het begrijpen van de parameters die het lot van advertentievectoren na opname bepalen, kan een mogelijkheid bieden voor vectorontwerp.

4.1. Stabiliteit ligt in de soort

Receptor-gemedieerde opname en ontsnapping uit het endo-lysosomale compartiment zijn kenmerken van Ad-infectie en vectortransductie. De initiële opname wordt bepaald door de interactie van de virusvezel- en pentonmoleculen met celreceptoren. Vezel en penton komen voor bij alle advertenties, maar afhankelijk van hun soort werken ze samen met verschillende cellulaire receptoren (tabel 1). Soort C-virussen gebruiken CAR en binnendringende deeltjes ontsnappen uit een vroeg endosomaal compartiment [79]. Als soort C-virussen (Ad5) zijn gemanipuleerd om een ​​vezelmolecuul van een soort B-virus (Ad16) te bevatten, ontsnapt het resulterende deeltje (Ad5F16) uit een lysosomaal compartiment (zoals blijkt uit kleuring met de lysosomale merker LAMP1) in plaats van de vroege endosoom [351]. Deze vertraagde ontsnapping uit lysosomen is een eigenschap die wordt gedeeld met alle geteste soorten B-virussen [111,352,353].

Bovendien wekken zowel de hybride Ad5F16-virussen als soorten B-virussen een sterkere pro-inflammatoire respons op dan soorten C-virussen [159,351]. Dit wordt toegeschreven aan verhoogde detectie via intraluminale TLR9 in immuuncellen [354]. Bovendien veroorzaakt lysosomale membraanschade, in tegenstelling tot vroege endosomale schade, sterke oxidatieve stress. Lysosoomruptuur geeft samen lysosomale hydrolasen vrij, zoals cathepsine B, die mitochondria kunnen beschadigen, waardoor de schaderespons door ontstekingsactivatie wordt versterkt [355-357]. Het Ad-opnameproces destabiliseert de capside, waardoor het virale eiwit VI vrijkomt [103,106]. Vrijgekomen proteïne VI dringt vervolgens het membraan binnen vanuit het endo-lysosomale compartiment om het virus toegang te geven tot het cytosol. Vergelijking van soorten C en B laat zien dat beide virussen even efficiënt zijn in het binnendringen van het cytosol en het afleveren van het genoom, maar verschillen in hun ontsnappingskinetiek [111]. Het feit dat een simpele vezelwissel de ingangs- en immunogene eigenschappen van soort B- naar soort C-virus kan overdragen, is opmerkelijk. Het biedt een proof of concept dat hybride vectoren met specifieke eigenschappen kunnen worden ontworpen. Het onderliggende verschil lijkt te zijn dat de afgifte van proteïne VI vertraagd is in soorten B-virussen (of het hybride virus) en mogelijk verzuring of een andere, onbekende trigger voor demontage vereist.

Aangezien de afgifte van proteïne VI in dit geval wordt vertraagd, zou dit een verhoogde capside-stabiliteit kunnen weerspiegelen. Er werd inderdaad aangetoond dat soorten C Ad5-virussen het vezelmolecuul vrijgeven bij celbinding, een stap waarvan wordt aangenomen dat deze de capside verzwakt en het demontageproces voor eiwit VI-afgifte voorbereidt. In deze context bleek vezelloos Ad5 minder stabiel te zijn dan natieve deeltjes [358]. Daarentegen geven niet-gerijpte, hyperstabiele Ts1 Ad2/5 geen vezels of eiwit VI vrij en zijn ze slechte inductoren van ontsteking, aangezien ze noch TLR9 triggeren noch membraanbeschadiging veroorzaken [114,138,359,360].

Of het verwisselen van vezels met soort B de aanvankelijke vrijgave van vezels voorkomt en de capside van soort C stabieler maakt, is niet onderzocht, maar is waarschijnlijk. Capside-stabiliteit kan een essentiële bepalende factor zijn voor het lot van capside na binnenkomst en, bij uitbreiding, een kenmerk dat zou kunnen worden benut voor vectorontwerp. Soort B-virussen kunnen stabieler zijn door het gebruik van een andere receptor of door een unieke vezel-penton-interactie. Daarentegen infecteren soorten F-virussen Ad40/41 het maagdarmkanaal en hebben ze een verhoogde capside-stabiliteit vanwege hun tropisme en hun aanpassing aan de barre darmomgeving [24,361]. De darm heeft een intrinsieke temperatuur die een paar graden boven de bovenste luchtwegen ligt die het doelwit zijn van soorten C-virussen (37 ◦C vs. 33 ◦C) [362]. Ad40/41 zijn dus intrinsiek meer thermostabiel, ondersteunen het infectieproces [24], waardoor ze ook moeilijk te verspreiden zijn [24,361,363].

Bovendien missen ze een RGD-motief in het pentonmolecuul, wat resulteert in een verder verminderde celinvoer [92]. Of deze unieke capside-eigenschappen zich vertalen in een ontsnapping uit een lysosomaal compartiment of gedeeltelijke demontage/eiwit VI-afgiftedefecten bij binnenkomst is niet bekend. Deze eigenschappen kunnen daarentegen een context bieden voor de ontwikkeling van orale vaccintoepassingen. In tegenstelling tot vezels van soort B, hebben vectoren die vezels van soort F bevatten een verminderde immuunactivatie [364] wanneer ze worden toegepast op standaard omgevingsomstandigheden. Als een bepaalde menselijke Ad-soort nu uit zijn verband wordt gehaald en als vaccinvector wordt gebruikt, zou het de moeite waard kunnen zijn om naar het natuurlijke tropisme van deze vector te kijken om aanwijzingen te zoeken om zijn gedrag te voorspellen. De momenteel gebruikte vaccinvector op basis van Ad26 is een soort D-virus, en zijn natuurlijke tropisme zijn de ogen en het maagdarmkanaal [365]. Soort D-virussen, waaronder Ad26, zijn minder immunogeen dan Ad5 [366] en er werd aangetoond dat ze naar het late endosomale compartiment gaan, waarschijnlijk met een vertraagde eiwit VI-afgifte.

Bijgevolg verminderde het blokkeren van de verzuring van het late endosomale compartiment de immunogeniciteit verder [113]. In tegenstelling tot humane Ads is de kennis van niet-humane Ads die ook gebruikt worden bij vaccinatie en vectorisatie zeer beperkt. Van chimpansees afgeleide advertenties, waaronder de ChAd3, zijn nauw verwant aan soorten D-virussen [367,368]. Interessant is dat Ad5-vectoren immunogener zijn dan van chimpansees afgeleide Ad-vectoren en een hoger transductiepotentieel hebben. Deze waarneming was niet gekoppeld aan verschillen in het penton RGD-motief of de vezel, en de mechanistische reden blijft onbekend [369]. Potentiële verschillen in capside-stabiliteit zijn niet onderzocht. Een andere niet-menselijke advertentie die als vector wordt gebruikt, is de canine Ad type 2 (CAV-2). Deze vector heeft de opmerkelijke eigenschap neuronen selectief te transduceren, maar niet omliggende gliacellen, in tegenstelling tot een Ad5-controlevector, ondanks dat beide vectoren dezelfde receptor gebruiken [370-372]. Dit vermogen kan worden gekoppeld aan verhoogde capside-stabiliteit, waardoor uncoating alleen in neuronale cellen mogelijk is. Honden hebben een lichaamstemperatuur die ~2 ◦C hoger is dan die van mensen, wat mogelijk resulteert in verhoogde CAV{16}} capside-stabiliteit [373], analoog aan de soort F-virussen. CAV-2 wekt slecht een aangeboren immuunrespons op, consistent met een gebrek aan efficiënte demontage in doelcellen [372]. CAV2-vectoren kunnen dus een ander voorbeeld zijn waarbij een biofysische eigenschap gekoppeld aan zijn natuurlijke tropisme of gastheer het potentieel heeft om nieuwe vectoreigenschappen te bieden.

4.2. Verfijning van de capsidestructuur, het voorbeeld van proteïne VI in soort C Ad2/5

Als capside-stabiliteit en proteïne VI-afgifte het stroomafwaartse lot van de virale capside bepalen, rijst de vraag of dit kan worden gewijzigd in Ad-vectoren, dwz om nieuwe eigenschappen toe te schrijven aan virale vectoren (Figuur 3). Het grootste deel van ons begrip van hoe advertenties het endo-lysosomale compartiment binnendringen, is afkomstig van de soort C-virussen Ad2/5. De ontdekking van proteïne VI als membraanlytische factor was essentieel om dit proces te begrijpen [103,106]. Eiwit VI codeert voor een N-terminale amfipathische helix die het eigenlijke membraanlytische deel van het eiwit is. Tijdens de virusproductie wordt eiwit VI tot expressie gebracht als een voorlopereiwit dat associeert met hexon-trimeren via de amfipatische helix [42,374]. Het complex wordt in de kern geïmporteerd via transportsignalen die zijn gecodeerd in de N- en C-terminus van proteïne VI, die worden verwijderd tijdens virusassemblage en rijping door het virale protease. Het C-terminale peptide van 11 aminozuren activeert ook het protease, wat een slimme manier biedt om virusassemblage te koppelen aan de afscherming van de amfipathische helix. Het Ts1 Ad2/5-mutantvirus heeft een verpakkingsdefect voor het protease en geen van de capside-eiwitten, inclusief eiwit VI, wordt verwerkt. De resulterende deeltjes zijn hyperstabiel, behouden vezels en zetten geen proteïne VI in.

Bijgevolg worden Ts1-deeltjes gesorteerd in lysosomen na receptor-gemedieerde endocytose. De exacte locatie van eiwit VI in het volgroeide virus is niet duidelijk, maar de gekloofde N-terminus lokaliseert zich op het binnenste hexonoppervlak van peripersoonlijke exons [37,104,375]. Er werd aangetoond dat tweepuntsmutaties in proteïne VI, G33A en S28C de stabiliteit van het Ad5-capside verhogen (Figuur 3A) [376,377]. De eerste mutant gaat vooraf aan de N-terminale protease-splitsingsplaats in proteïne VI en verstoort de verwerking. De resulterende deeltjes zijn gedeeltelijk onrijp en worden gekenmerkt door een endosoomlysisdefect, wat suggereert dat de N-terminus van proteïne VI intra-virion eiwit-eiwit interacties stabiliseert [376]. De tweede mutant werd gekozen vanwege zijn vermogen om intramoleculaire disulfidebruggen te vormen [377].

Het virus bevatte gedeeltelijk onverwerkte eiwitten, mogelijk inclusief eiwit VII, maar vertoonde verrassend genoeg geen besmettelijke defecten, ondanks de verhoogde stabiliteit. Of een van de virussen een veranderd immuunactiveringsprofiel heeft, is niet bekend. Een andere puntmutatie in proteïne VI die het lot van het virus beïnvloedt, is de proteïne VI L40Q-mutatie, direct gesitueerd in de amfipathische helix (Figuur 3A) [378,379]. Virussen met deze mutatie rijpen normaal maar zijn gedeeltelijk defect voor de endosoomlysisstap. In tegenstelling tot de bovengenoemde mutanten zijn L40Q-virionen minder stabiel dan hun wildtype tegenhangers. In plaats van een vertraging worden zowel proteïne VI als penton voortijdig vrijgegeven uit de L40Q-capside. L40Q-virionen zijn minder besmettelijk en onderhevig aan gedeeltelijke lysosoomsortering. De L40Q-mutatie heft de membraanlysis echter niet volledig op en sommige virussen ontsnappen naar het cytosol, wat resulteert in een algehele ~viervoudig verminderde infectiviteit van een L40Q-vector [379,380]. De waarnemingen suggereren dat de amfipatische helix met zijn interactie bijdraagt ​​aan de deeltjesstabiliteit. Het is niet bekend of en hoe de L40Q-mutatie de immunogene eigenschap van Ad5-vectoren verandert. Recente waarnemingen suggereren dat de afgifte van eiwit VI uit de capside wordt veroorzaakt door interne concurrentie met eiwit VII voor dezelfde of overlappende bindingsplaatsen in exons [375].

Consequent slaagt een mutant virus zonder eiwit VII er niet in om uit het endosoom te ontsnappen en heeft het een defect in endosoomlysis [58]. Een beter begrip van de structurele en dynamische organisatie van de interne capside (dwz proteïne VI) en kernproteïnen (dwz proteïne V en VII) in het deeltje en tijdens celintreding zal enorm helpen om te begrijpen wat de (reversibele) capside-stabiliteit bepaalt.

Het beheersen van de efficiëntie van immuunactivering van Ad-vectoren is van groot belang voor de ontwikkeling van vaccins, en het uitbreiden van de MHC-presentatie van antigenen zou de ontwikkeling van vaccins verbeteren [381]. Zoals eerder vermeld, reguleert autofagie de activering van het immuunsysteem en voedt het peptiden naar de MHC. Autofagie is een van de oudste cellulaire verdedigingsmechanismen tegen infectie, maar advertenties, als aangepaste menselijke ziekteverwekkers, hebben geen mechanismen ontwikkeld om autofagie bij binnenkomst te voorkomen. In plaats daarvan lijken ze autofagie-activering te omarmen en de verantwoordelijkheid af te leiden naar het bevorderen van infectie. Eiwit VI speelt een centrale rol bij het beheersen van de autofagie-respons van de cel. Adenovirusmembraanlysis door eiwit VI leidt tot de rekrutering van galectine 3 en galectine 8, die door de cel worden herkend als gevaarsignalen (Figuur 3B) [108,109,382]. Detectie van advertentie-penetratieplaatsen door galectines activeert selectieve autofagie in de geïnfecteerde cel, zoals geïllustreerd door de rekrutering van autofagie-receptoren (bijv. NDP52 en p62) en LC3 punctae-vorming [108].

Interessant is dat Ad5-vectordeeltjes erin slagen te ontsnappen uit het gescheurde endosoom en naar de kern kunnen gaan. Het remmen van autofagie heeft geen invloed op de virale besmettelijkheid, maar vertraagt ​​de aflevering van het genoom aan de kern, wat aantoont dat advertenties de cellulaire machinerie kapen voor hun winst [108]. Ontsnapping uit het endosoom zorgt er daarom voor dat het virus afbraak door autofagie kan voorkomen via een actief proces. Dit proces werd ontdekt door nog een andere proteïne VI-mutant, de M1-mutant. Alle menselijke advertenties (en verschillende niet-menselijke advertenties) coderen voor een sterk geconserveerd PPxY-peptidemotief in eiwit VI. In de M1-mutant werd dit motief veranderd in PGAA (Figuur 3) [104]. Zowel het wildtype als de M1-mutant geven efficiënt eiwit VI vrij bij binnenkomst en veroorzaken autofagie na breuk van het endosomale membraan. Het M1-mutantvirus kan echter niet efficiënt ontsnappen in het cytosol, en EM-beelden hebben aangetoond dat M1-mutantvirussen vastzitten in gescheurde endosomen, het doelwit van autofagie.

Bijgevolg bleek het M1-mutante virus een sterk besmettelijkheidsdefect te hebben, dat wordt hersteld door de farmacologische en genetische remming van autofagie. De studie toonde aan dat wildtype virussen hun PPxY-motief gebruiken om de ubiquitine-ligase NEDD4.2 te rekruteren en de rijping van autofagosomen lang genoeg te beperken om naar het cytosol te ontsnappen. Bovendien stelt deze eigenschap het virus in staat zijn antigene presentatie te beperken [108]. Belangrijk is dat de M1-mutante vector die in muizen werd geïnjecteerd, resulteerde in een veel sterkere anti-vectorimmuniteit en een verminderde CD8 plus-respons op het gecodeerde transgen, wat aantoont dat een eenvoudige capside-verandering een grote invloed kan hebben op de immunogeniciteit van de Ad5-capside. Of een van de andere eiwit VI-mutaties de immunogeniciteit beïnvloedt, is niet bekend. De aanwezigheid van het PPxY-motief in het L40Q-virus kan echter verklaren waarom de vector een relatief hoge infectiviteit behoudt ondanks het membraanlysisdefect [379,380]. Omdat de endosomale lysis minder efficiënt is en L40Q-vectoren gedeeltelijk in het lysosomale compartiment terechtkomen, is het denkbaar dat de opgewekte immuunrespons toch verschilt van wildtype-, Ts1- of M1 Ad5-capsiden.