Deel 1: Cistanoside van Cistanche Herba verbetert door hypoxie veroorzaakte mannelijke reproductieve schade door onderdrukking van oxidatieve stress
Mar 26, 2022
Contact:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791
Fengqi Yan1*, Xiaoliang Dou1*, Guangfeng Zhu1*, Mingyuan Xia1, Yahui Liu3, Xiaozi Liu3, Guojun Wu2, HeWang1, Bo Zhang1, Qiuju Shao4, Yong Wang1
Abstract:Toenemend bewijs toont aan dat hypoxie een oorzaak is van mannelijke onvruchtbaarheid, en hypoxie kan verband houden met oxidatieve stress (OS). Cistanoside (Cis) is een fenylethanoïde glycosideverbinding die kan worden geëxtraheerd uit CistanchesHerba en verschillende biologische functies heeft. Deze studie had tot doel de beschermende effecten van Cis op reproductieve schade veroorzaakt door hypoxie te onderzoeken en de specifieke onderliggende mechanismen te onderzoeken. Experimentele modellen voor cel- en dierhypoxie werden geconstrueerd en de beschermende effecten van verschillende subtypes van Cis op het mannelijke voortplantingssysteem werden zowel in vitro als in vivo beoordeeld. De resultaten gaven aan dat hypoxie de levensvatbaarheid van GC-1-cellen aanzienlijk verminderde door stopzetting van de celcyclus en apoptose-activering, die geassocieerd waren met een verhoogde OS.Bovendien vertoonde Cis sterke antioxidatieve effecten, zowel in vitro als in vivo, waardoor de antioxidant-enzymactiviteiten aanzienlijk werden hersteld. en het neerwaarts reguleren van de niveaus van reactieve zuurstofsoorten (ROS), terwijl de levensvatbaarheid van de cellen wordt verhoogd en apoptose wordt verminderd. Belangrijk is dat de hierin bestudeerde Cis-subtypes (Cis-A, Cis-B, Cis-C en Cis-H) allemaal bepaalde antioxiderende effecten vertoonden, waarvan de effecten van Cis-B het meest significant waren. Deze studie toont aan dat Cis de schadelijke effecten van door hypoxie geïnduceerde OS duidelijk afzwakt door de antioxiderende enzymactiviteiten in testikels en GC-1cellen te beïnvloeden.
Trefwoorden: Cistanoside, hypobare hypoxie, mannelijke onvruchtbaarheid, oxidatieve stress, reproductieve bescherming
verse cistanche plant
Invoering
Momenteel worden wereldwijd ongeveer 48,5 miljoen (15 procent) paren in de vruchtbare leeftijd getroffen door onvruchtbaarheid [1], waarvan 40-50 procent van de gevallen wordt toegeschreven aan mannelijke onvruchtbaarheid [2], een aandoening die sterk verband houdt met de omgeving en levensstijl factoren. Er zijn aanwijzingen dat de gevoeligheid van de testis van zoogdieren voor lage zuurstofdruk een oorzakelijke factor is van sommige vormen van mannelijke onvruchtbaarheid [3]. Zoals aangetoond in eerdere studies, wordt de spermatogenese verminderd en verminderd bij blootstelling aan hypobare hypoxie [4-7].
Om het onderliggende mechanisme te onderzoeken, hebben onderzoeken aangetoond dat blootstelling aan hypobare hypoxie de productie van reactieve zuurstofsoorten (ROS) verhoogt [8, 9]. ROS speelt een belangrijke rol in het mannelijke voortplantingssysteem. Bij lage niveaus zijn ze nodig voor de capacitatie van sperma, de acrosoomreactie en spermatozoa-oöcytfusie [10]. Overmatige ROS kan echter sperma-nucleaire/mitochondriale DNA-schade en peroxidatieve schade aan het plasmamembraan veroorzaken, die op hun beurt belangrijke etiologische factoren zijn voor het verhoogde risico op mannelijke onvruchtbaarheid [11, 12]. De accumulatie van door hypoxie geïnduceerde ROS kan dus een oorzaak zijn van mannelijke onvruchtbaarheid.
Cistanches Herba, een meerjarige parasitaire medicinale plant, is wijdverbreid in droge gebieden [13]en wordt veel gebruikt vanwege zijn farmacologische activiteiten [14-17]. Van alle effectieve inhoud van Cistanches Herba zijn PhG's beschouwd als het belangrijkste actieve bestanddeel. Tot op heden zijn 34 PhG's geïsoleerd uit Cistanches-planten [13]. Cistanoside (Cis), anactief PhG geïsoleerd uit Cistanches Herba, heeft aandacht gekregen vanwege zijn antioxiderende effecten.
Gezien de antioxiderende effecten van Cis en de rol van ROS bij door hypoxie geïnduceerde mannelijke onvruchtbaarheid, wordt Cis beschouwd als een potentiële kandidaat-geneesmiddel voor de behandeling van door hypoxie geïnduceerde mannelijke onvruchtbaarheid. Er zijn echter maar weinig rapporten die de antioxiderende effecten van Cis, gewonnen uit Cistanches Herba, behandelen bij de behandeling van door hypoxie veroorzaakte mannelijke onvruchtbaarheid of de betrokken signaalroutes. In deze studie werden in vitro en in vivo hypoxie-experimentele modellen geconstrueerd en werden de effectcomponenten van verschillende Cis beoordeeld.
Cistanche heeft eenreproductief productie-effect.
materialen en methodes
Celcultuur en reagens
De muis spermatogonia-cellijn GC-1spg(GC-1) werd gekocht bij de American TypeCulture Collection (ATCC) en gekweekt in DMEM (Invitrogen, VS) aangevuld met 10 procent foetaal runderserum, 1 procent L- glutamine (100 mM), penicilline (100 U/mL) en streptomycine (100 ug/mL) bij 37 graden in een bevochtigde incubator met 5 procent CO2. Cis (Cis-A, B, C, H) werd gekocht bij Chengdu Gelipu Biotechnology Co., Ltd. (China).
Levensvatbaarheidstest van de cel
De levensvatbaarheid van de cellen werd getest door middel van een celtelkit{{0}}assay (CCK-8). In het kort werden GC-1-cellen gezaaid in 96-putjesplaten met 1,5 x 103 per putje en 24 uur gekweekt bij 37 graden. Vervolgens werden de cellen behandeld met verschillende concentraties (20 procent, 15 procent, 10 procent, 5 procent) zuurstof of verschillende concentraties (2 M, 0,2 M, 0,02 M) van Cis (Cis-A, Cis-B, Cis-C , Cis-H) voor de vereiste tijd. Vervolgens werd het supernatant weggegooid en werd de levensvatbaarheid van de cellen gedetecteerd met behulp van een CCK-8-kit (DojindoJapan). De absorptie van elk putje werd gemeten bij 450 nm met behulp van een microplaatlezer (BioRad USA). Ten slotte werden de levensvatbaarheid van de cellen berekend volgens de volgende formule:
Levensvatbaarheid van cellen=(ODexperimentele groep - ODblank-groep)/(ODcontrolegroep - ODblank-groep) × 100 procent.
Western-blot-analyse
Geoogste cellen of weefsels werden gehomogeniseerd in RIPA-buffer om eiwitten te extraheren (RIPA BeyotimeChina; Cocktail Roche Zwitserland). Supernatanten werden verzameld en de concentratie van eiwitten werd getest met de BCA-methode (Beyotime). Ongeveer 40 ug van de geëxtraheerde eiwitten van elk monster werd gescheiden door SDS-PAGE en elektrisch overgebracht op nitrocellulose (NC) filtermembraan (BeyotimeChina). NC-filtermembranen werden gedurende 1,5 uur geblokkeerd met 5% magere melk en geïncubeerd met specifieke antilichamen (anti-PARP 1:1000, anti-Caspase-3 1:1000, anti-Bcl-2 1:1000, anti-Bax1: 1000, anti-GAPDH 1:1000; alle antilichamen werden overnacht bij 4°C gekocht bij Cell Signaling Technology, USA). Vervolgens werden alle NC-membranen gedurende 1,5 uur bij kamertemperatuur geïncubeerd met het overeenkomstige met mierikswortelperoxidase geconjugeerde secundaire antilichaam en afgebeeld met een beeldvormingssysteem (Tannon, China).
cistanche extract poeder supplementen
Detectie van celcyclus
Een flowcytometrische test (FCM) werd uitgevoerd om de celcyclus te analyseren. Cellen werden 72 uur onder verschillende omstandigheden behandeld en geoogst. De cellen werden vervolgens gewassen met PBS, gefixeerd in 75 procent ethanol en gekleurd met propidiumjodide (PI). Voor elk monster werden 1 x 104 cellen verzameld en geanalyseerd met flowcytometrie (FACSCalibur, BD Biosciences). Vervolgens werd het aandeel G1/S/G2-fasecellen en de proliferatie-index [Fase (S plus G2)/Fase (G1 plus S plus G2) x 100 procent berekend.
Ki-67 kleuring
Cellen werden gekweekt in een confocale schaal en 72 uur behandeld met hypoxie of verschillende subtypes van Cis. Nadat alle cellen met 4 procent paraformaldehyde waren gefixeerd, werden ze geïncubeerd met anti-Ki-67 antilichaam (1:200, Cell Signaling Technology). Vervolgens werden alle cellen geïncubeerd met een overeenkomstig CY-3-geconjugeerd anti-konijn IgG-antilichaam (1:200, Boster, China) en DAPI-oplossing (1,0 ug/ml, Beyotime). Fluorescentie werd waargenomen met een Fluoview FV1000 confocale microscoop (Olympus, Japan).
Detectie van ROS
FCM werd geïntroduceerd om intracellulaire ROS-niveaus te meten met behulp van DCFH-DA. Gesuspendeerde cellen werden uitgezaaid in 6-putjesplaten en onderworpen aan verschillende behandelingen. Na 72 uur behandeling werden cellen gesuspendeerd in serumvrij DMEM met 10 μM DCFH-DA (Beyotime). ROS-gehalten werden vervolgens bepaald door fluorescentie-geactiveerde celsortering op een Beckman Coulter Flow CytometrySystem met een excitatiegolflengte van 488 nm en een emissiegolflengte van 525 nm [18].
Bepaling van lipideperoxidatie (LPO)
De thiobarbituurzuur reactieve stoffen (TBARS) test werd uitgevoerd om LPO te detecteren. Allopererende stappen werden uitgevoerd in overeenstemming met de instructies (Sigma USA). De concentraties werden berekend met behulp van een molaire extinctiecoëfficiënt van 1,56 x 105/(M.cm), die werd verkregen met malondialdehyde als standaard. De resultaten worden uitgedrukt als nmol MDA-equivalenten/mg eiwit.
Bepaling van enzymactiviteiten
De enzymactiviteiten werden getest met behulp van testkits, waaronder glutathionreductase (GR), glutathionperoxidase (GPx) en superoxidedismutase (SOD). Alle bedieningsstappen werden uitgevoerd in overeenstemming met de meegeleverde instructies (Nan Jing Jian Cheng BioengineeringInstitute China).
Dieren en experimenteel protocol
Volwassen mannelijke Wistar-ratten (180-220 g, 8 w oud) werden verkregen van het dierencentrum van de Fourth Military Medical University, Xi'an, China. Toestemming voor het gebruik van de dieren werd verkregen van de University Ethics Committee (referentienummer : 20190506). Het dierexperiment is uitgevoerd volgens universitaire richtlijnen voor de verzorging en het gebruik van proefdieren.
Alle ratten mochten zich ongeveer een week voor aanvang van het experiment aanpassen. Na acclimatisatie werden de ratten willekeurig verdeeld in 6 groepen met 5 dieren in elke groep. De ratten in de controlegroep werden grootgebracht onder normale druk (PO2: 20 procent; luchtdruk: 101,3 kPa), terwijl de ratten in de model- en de met Cis behandelde groepen werden grootgebracht in een zuurstofkamer met lage druk (interne druk van 61,6 kPa, equivalent aan een hoogte van 4000 meter boven zeeniveau; PO2: 14,55 procent) om een hypoxische omgeving op grote hoogte te simuleren. Alle ratten hadden vrije toegang tot voedsel en water in plastic kooien bij 22 ± 2 graden en vochtigheid met een automatische 12- uur licht/donker cyclus. De ratten in de met het model en met Cis behandelde groepen bleven onder hypobare omstandigheden maar werden elke 96 uur overgebracht naar normobare omstandigheden, op welk moment voedsel en water aan hen werden verstrekt en de kooien werden schoongemaakt. De duur van de overgang van hypobaar naar hypobaar was ongeveer 2 uur. Alle behandelingsgroepen werden gedurende 8 weken via orale sondevoeding behandeld met het overeenkomstige Cis (8 mg/kg/d), terwijl de controle- en modelratten werden behandeld met een gelijk volume water.
Na 8 weken werden ratten onder verdoving opgeofferd. Testes, epididymis en zaadblaasjes werden gescheiden en gewogen, en de orgaanindex werd berekend volgens de volgende formule: (gewicht van orgaan/diergewicht) x 100 procent. Vervolgens werd sperma in de epididymis verzameld en werd hun beweeglijkheid en acrosoomenzymactiviteit getest. Evenzo werden testiculaire weefsels verzameld voor histopathologische studies en detectie van ROS, LPO en antioxidant-enzymactiviteit.
Evaluatie van de snelheid van levend sperma
De epididymis werd ingesneden met een chirurgische schaar en de spermasuspensie werd bereid in normale zoutoplossing. Om de snelheid van levend sperma te evalueren, werd 5 L van de spermasuspensie zorgvuldig gemengd met een gelijk volume eosine-Ystain. Het sperma werd vervolgens geteld onder een lichtmicroscoop. Het percentage levend sperma werd bepaald door zowel gekleurd (doodsperm) als ongekleurd sperma (levend sperma) te berekenen.
Cistanche tubulosa poederverhoogt delive sperma tarieven.
Voor meer informatie, klik hier.
Bepaling van de enzymactiviteit van het acrosoom van het sperma
De sperma-acrosoom-enzymactiviteitstest werd gebruikt om sperma-acrosoomenzymen te evalueren [19]. De resultaten in elke groep werden berekend met behulp van de volgende formule: Acrosoom-enzymactiviteit (μIU)=(ODExperimentgroep - ODBlank-groep)/(247,5×10) × 106.
statistische analyse
Alle kwantitatieve gegevens worden uitgedrukt als het gemiddelde ± SD en zijn geanalyseerd met SPSS 22.0-software. De t-test van Independent Student werd gebruikt om de gegevens tussen twee groepen te vergelijken. *P< 0.05="" and="" **p="" <="" 0.01="" were="" considered="" statistically="" significant="">
